[發明專利]一種基于CRISPR-Cas9系統的外泌體microRNA檢測生物傳感器及檢測方法

在審

• 申請號: 202310549883.0
• 申請日: 2023-05-16
• 公開（公告）號: CN116574788A
• 公開（公告）日: 2023-08-11
• 發明（設計）人: 黃琳;周夢洋
• 申請（專利權）人: 安徽醫科大學
• 主分類號: C12Q1/6825
• 分類號: C12Q1/6825;C12N15/11;C12N9/22
• 代理公司: 合肥兆信知識產權代理事務所(普通合伙) 34161
• 代理人: 汪洋

本發明公開了一種基于CRISPR?Cas9系統的外泌體microRNA檢測生物傳感器及檢測方法，其中，生物傳感器包括：sgRNA復合物，通過納米材料、復合物活性抑制探針、sgRNA之間的反應構建形成；識別探針，用于與脫氧核苷酸、聚合酶和外切酶配合，構建形成雜交反應體系，經過后續處理，形成sgRNA最終復合物；結合有熒光染料的靶標雙鏈DNA，用于與sgRNA最終復合物反應，生成附著有熒光染料的上清液，從而建立相關線性曲線。本發明提出的生物傳感器可配制成試劑盒，對外泌體中多種microRNA進行同步檢測，整體檢測操作更加便捷，檢測效率相對更高，具體檢測結果更為直觀，且具有良好檢測靈敏度和準確性。

技術領域

本發明涉及RNA檢測技術領域，具體為一種基于CRISPR-Cas9系統的外泌體microRNA檢測生物傳感器及檢測方法。

背景技術

腫瘤作為一種致死率高的疾病，早期診斷的及時發現是提高生存率和治療效果的關鍵。因此，液體活檢作為一種有前景的早期診斷方法，通過檢測循環腫瘤DNA(ctDNA)、miRNAs、循環腫瘤細胞(CTCs)、外泌體等被廣泛研究。

其中，外泌體是細胞分泌的一種具有膜結構的囊泡，大小為30-150nm，其通常在多泡體(MVBs)中產生，并通過MVBs與細胞膜的融合分泌到細胞外液中。大量的研究表明，含有母細胞來源的蛋白質、脂類和核酸的外泌體在細胞間的交流中起著重要作用，并具有作為腫瘤診斷體液活檢標志物的巨大潛力。這主要是因為其成分不僅可以反映原癌細胞遺傳信息等的改變，還可以在體液中穩定存在并具有高的濃度(≥10⁹/mL)。因此，相對于其它的液體活檢標志物，外泌體也具有很大的優勢。

目前，外泌體中發現的潛在標志物主要包括蛋白質、RNA(microRNA、lnc-RNA、mRNA)和DNA(dsDNA、mtDNA、ssDNA)。其中，microRNA是RNA中較易檢測的靶標，且已有多種microRNA被認為與腫瘤的發生發展相關，如microR-21、microR-141、microR-200a、microR-203、microR-205和microR-214等。

目前，現有的外泌體中microRNA的檢測方法大多是針對外泌體中單一的microRNA，無法同時檢測種類較多的microRNA。由于與腫瘤發展相關的microRNA種類較多，單一microRNA的檢測結果不夠全面，可能會降低其對腫瘤診斷的精確度和準確性。這就需要對每種相關的microRNA均進行定量檢測，然而，按現有技術的檢測方法，每檢測一種microRNA，需要按照相關檢測方法流程重新操作一次，整體的檢測效率不高，另外，其檢測靈敏度和準確性也相對較低。

如：中國發明專利(授權公告號：CN105063209B，授權公告日：2017.12.12)公開了一種外泌體miRNA的定量檢測方法，該發明方法是基于特異性的唯一標簽接頭的標記，對每個原始模板進行區分，避免了擴增時分子間存在的偏好性，可以精確檢測低于10拷貝以下的miRNA分子，且特異性高，可用于腫瘤源性的外泌體miRNA的檢測，神經退行性疾病、心血管疾病，生育健康等領域的檢測，可為疾病的早期篩查提供依據。

但是，該檢測方法在檢測過程中還需要依賴miRNA文庫的篩選以及計算機算法的糾錯等步驟，最終的檢測結果準確度取決于算法的優劣，且無法進行現場檢測，在檢測便捷度和檢測結果的準確性上還有待提高。

發明內容

本發明的目的在于提供一種基于CRISPR-Cas9系統的外泌體microRNA檢測生物傳感器及檢測方法，以解決上述背景技術中提出的問題。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：

一種基于CRISPR-Cas9系統的外泌體microRNA檢測生物傳感器，包括：