[發明專利]一種能高效分解單氰胺和氧化亞磷酸鹽的重組枯草芽孢桿菌及其構建方法與應用

在審

• 申請號: 202310523928.7
• 申請日: 2023-05-10
• 公開（公告）號: CN116286583A
• 公開（公告）日: 2023-06-23
• 發明（設計）人: 孫文俊;張凱杰;陳勇;應漢杰;陳天鵬;高勇;王丹;劉靜;王斯楠
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/75;C12N15/60;C12N15/53;C12R1/125
• 代理公司: 江蘇圣典律師事務所 32237
• 代理人: 仲凌霞;肖明芳

本發明公開了一種能高效分解單氰胺和氧化亞磷酸鹽的重組枯草芽孢桿菌及其構建方法與應用，所述重組枯草芽孢桿菌在枯草芽孢桿菌中表達氰胺水合酶和亞磷酸鹽脫氫酶。本發明所提供的重組枯草芽孢桿菌能分解單氰胺產生尿素作為氮源，分解氧化亞磷酸鹽成為磷酸鹽作為磷源，改變氮源和磷源的來源途徑，使其在特定的MOPS培養基中能正常生長，而不同時具有這兩條代謝途徑的雜菌微生物就會由于缺乏氮源或磷源營養物質的來源而被“餓死”，從而使重組枯草芽孢桿菌成為特定培養基的優勢菌，雜菌就不能生長繁殖。

技術領域

本發明涉及生物領域，具體涉及一種能高效分解單氰胺和氧化亞磷酸鹽的重組枯草芽孢桿菌及其構建方法與應用。

背景技術

近年來，隨著發酵行業的迅速發展，發酵技術、發酵設備不斷發展更新，在發酵管理經驗越來越豐富，技術手段越發成熟的情況下，各企業的發酵染菌率也有下降。但工業發酵過程環節較多，染菌現象還是時有發生，并且一旦染菌，不僅造成原材料浪費，而且會影響生產效率，增加生產成本，破壞生產計劃、擾亂生產秩序等。所以，要解決發酵中的染菌依舊是發酵企業最關切的問題之一。

造成發酵染菌的原因有很多，且常因工廠不同而有所不同，但設備滲漏、空氣凈化達不到要求、種子帶菌、培養基滅菌不徹底和技術管理不善等是造成各廠污染雜菌的普遍原因。通常，為了解決發酵過程中微生物污染的問題。一般是采用增加滅菌過程和添加抗生素。但是，濫用抗生素會加速耐藥菌株的產生，而滅菌過程將導致高能耗和高成本。并且，滅菌過程中的高溫也會導致美拉德反應的發生。培養基中的糖和氨基酸發生美拉德反應后，會導致營養物質的流失，從而降低產量。而對工業菌株進行基因工程方面的改造，使其能夠利用一些罕見的化學物質在發酵過程中抵抗環境微生物的污染，這在近幾年成為了研究熱點。

在分子生物學中，基因的重組表達技術已經相當成熟，可以利用基因工程的手段把不同來源的基因實現在同一菌株中共表達，從而可以賦予該菌株擁有其他菌株自身不具備的一些特殊代謝功能，使其能在發酵工業中得到更廣泛的應用，降低生產成本和設備要求。

枯草芽孢桿菌作為安全級菌株，由于其清晰的遺傳背景、高效的分泌能力、簡單的培養條件等優勢被廣泛的應用于生物技術產業。其無論是用來高效表達外源蛋白還是作為口服疫苗或全細胞酶的載體，都展現出其他細菌無可比擬的優勢，是研究較多、應用較廣泛的菌株。但其在培養或者發酵產物過程中會受到雜菌污染，導致發酵效率降低、全細胞酶的催化效果下降，從而造成巨大的經濟損失。

發明內容

發明目的：本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的不足，提供一種能高效分解單氰胺和氧化亞磷酸鹽的重組枯草芽孢桿菌。

本發明還要解決的技術問題是提供上述重組枯草芽孢桿菌的構建方法。

本發明還要解決的技術問題是提供上述重組枯草芽孢桿菌的應用。

發明思路：本發明以大腸桿菌DH5α工程菌為宿主，將克隆得到的氰胺水合酶基因和亞磷酸脫氫酶基因依次連接在載體上得到重組質粒，并轉化入枯草芽孢桿菌168表達菌株中，培養得到重組枯草芽孢桿菌。本發明的重組枯草芽孢桿菌同時含有氰胺水合酶基因和亞磷酸脫氫酶基因，能同時表達氰胺水合酶分解單氰胺生成尿素和表達亞磷酸脫氫酶把亞磷酸鹽氧化磷酸鹽，為重組枯草芽孢桿菌工程菌提供生長繁殖所需要的氮源和磷源，而其他微生物由于不具備這兩條獲取營養的代謝途徑，故使重組枯草芽孢桿菌在生長過程中成為了優勢菌，從而可以有效解決枯草芽孢桿菌在工業發酵中染菌問題，同時可以降低對發酵設備的滅菌以及減少抗生素的添加。

為了解決上述第一個技術問題，本發明公開了一種能高效分解單氰胺和氧化亞磷酸鹽的重組枯草芽孢桿菌，所述重組枯草芽孢桿菌在枯草芽孢桿菌中表達氰胺水合酶和亞磷酸鹽脫氫酶。

其中，所述枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌168；所述氰胺水合酶和亞磷酸鹽脫氫酶的核苷酸序列分別如SEQ?ID?NO.1和SEQ?ID?NO.2所示。