[發(fā)明專利]一種高產(chǎn)莫匹羅星的熒光假單胞菌基因工程菌株及制作方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202310517175.9
• 申請(qǐng)日: 2023-05-09
• 公開（公告）號(hào): CN116426453A
• 公開（公告）日: 2023-07-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳小剛;張博;尚睿婧;于小喻
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣西大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N15/54;C12N15/31;C12N15/78;C12P17/16;C12R1/39
• 代理公司: 新余市渝星知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 36124
• 代理人: 張瑜生

本發(fā)明提供一種高產(chǎn)莫匹羅星的熒光假單胞菌基因工程菌株及制作方法，該基因工程菌株是通過(guò)敲除熒光假單胞菌2P24中spoT、relA、mvaT和rsaL基因后而獲得,它可使莫匹羅星的發(fā)酵產(chǎn)量由3mg/mL提升到了15mg/mL，為降低莫匹羅星的生產(chǎn)成本提供了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種高產(chǎn)莫匹羅星的熒光假單胞菌基因工程菌株及制作方法。

背景技術(shù)

莫匹羅星(mupirocin)，也被稱為假單胞菌酸A，是一種局部外用的廣譜醫(yī)用類抗生素，可抑制肺炎克氏桿菌(Klebsiella?pneumoniae)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和肺炎鏈球菌(Streptococcus?pneumoniae)等革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌以及大腸埃希氏菌(Escherichia?coli)、流感嗜血桿菌(Haemophilus?influenzae)和淋病奈瑟氏球菌(Neisseria?gonorrhoeae)等革蘭氏陰性細(xì)菌的生長(zhǎng)。莫匹羅星的作用機(jī)制是通過(guò)抑制病原菌中異亮氨酸-tRNA合酶的活性，影響肽鏈的合成，從而起到抑菌或殺菌的作用。

莫匹羅星由熒光假單胞菌(Pseudomonas?fluorescens)產(chǎn)生，其表達(dá)受到多個(gè)遺傳因子的嚴(yán)格調(diào)控。熒光假單胞菌2P24中，PcoI-PcoR群體感應(yīng)系統(tǒng)(quorum-sensingsystem)是莫匹羅星產(chǎn)生所必需的。當(dāng)細(xì)菌細(xì)胞濃度達(dá)到一定閾值時(shí)，PcoI合成的信號(hào)分子與轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子PcoR相結(jié)合，從而激活PcoR。被活化的PcoR則結(jié)合到莫匹羅星合成基因簇啟動(dòng)子區(qū)域，促進(jìn)莫匹羅星合成基因簇。因此缺失pcoI基因或pcoR基因可顯著降低菌株2P24中莫匹羅星的產(chǎn)量。除PcoI-PcoR群體感應(yīng)系統(tǒng)外，轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子MvaT和RsaL通過(guò)不同的信號(hào)通路調(diào)控莫匹羅星的產(chǎn)生。研究表明缺失mvaT基因或rsaL基因可顯著提高菌株2P24中莫匹羅星的產(chǎn)量。此外，由核苷酸五磷酸鳥苷或和四磷酸鳥苷(p)ppGpp信號(hào)介導(dǎo)的細(xì)菌嚴(yán)緊反應(yīng)途徑也參與調(diào)控莫匹羅星的合成過(guò)程。

莫匹羅星的合成分為化學(xué)合成法和生物合成法?；瘜W(xué)合成法需要多個(gè)化學(xué)反應(yīng)步驟，生產(chǎn)過(guò)程中，需要消耗大量的化學(xué)藥品和能源，且對(duì)環(huán)境不友好。因此生物合成法是目前廣泛用于莫匹羅星生產(chǎn)的方法。但目前的制作方法存在發(fā)酵水平低下這一突出問(wèn)題?；诖耍毙柰ㄟ^(guò)分子生物學(xué)等技術(shù)手段提高工程菌株中莫匹羅星的產(chǎn)量，從而降低生產(chǎn)成本。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種高產(chǎn)莫匹羅星的熒光假單胞菌基因工程菌株及制作方法，該基因工程菌株可使莫匹羅星發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)到15mg/mL，為降低莫匹羅星的生產(chǎn)成本提供了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

第一方面，本發(fā)明所提供的高產(chǎn)莫匹羅星的熒光假單胞菌的工程菌株，具體是敲除熒光假單胞菌2P24基因組中的spoT基因、relA基因、mvaT基因和rsaL基因，從而得到熒光假單胞菌基因工程菌2P24ΔATTL。

第二方面，本發(fā)明提供一種高產(chǎn)莫匹羅星的熒光假單胞菌基因工程菌株的制作方法，以產(chǎn)莫匹羅星的熒光假單胞菌2P24為出發(fā)菌株，分別將菌株2P24基因組上具有負(fù)調(diào)控功能的spoT、relA、mvaT和rsaL基因進(jìn)行敲除，從而得到高產(chǎn)莫匹羅星的熒光假單胞菌基因工程菌株2P24ΔATTL。

進(jìn)一步，spoT基因的敲除方法如下：

1)擴(kuò)增spoT基因上下游片段，通過(guò)融合PCR法將spoT基因上下游片段連接并克隆到p2P24Km自殺質(zhì)粒中得到spoT基因重組質(zhì)粒p2P24-spoT；

2)通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化將p2P24-spoT導(dǎo)入熒光假單胞菌2P24中；

3)通過(guò)蔗糖平板篩選、PCR篩選共同篩選得到工程菌株2P24ΔspoT；

進(jìn)一步的，spoT基因的序列如SEQ?ID?NO.1所示；