[發(fā)明專利]一種高產(chǎn)莫匹羅星的熒光假單胞菌基因工程菌株及制作方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 202310517175.9 | 申請日： | 2023-05-09 |
| 公開（公告）號： | CN116426453A | 公開（公告）日： | 2023-07-14 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 吳小剛;張博;尚睿婧;于小喻 | 申請（專利權(quán)）人： | 廣西大學(xué) |
| 主分類號： | C12N1/21 | 分類號： | C12N1/21;C12N15/54;C12N15/31;C12N15/78;C12P17/16;C12R1/39 |
| 代理公司： | 新余市渝星知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 36124 | 代理人： | 張瑜生 |
| 地址： | 530004 廣西*** | 國省代碼： | 廣西;45 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 高產(chǎn) 莫匹羅星 熒光 假單胞菌 基因工程 菌株 制作方法 | ||
1.一種高產(chǎn)莫匹羅星的熒光假單胞菌基因工程菌株，其特征在于，具體是敲除熒光假單胞菌(Pseudomonas?fluorescens)2P24基因組中的spoT基因、relA基因、mvaT基因和rsaL基因，所得到的熒光假單胞菌基因工程菌株2P24ΔATTL。
2.一種如權(quán)利要求1所述的高產(chǎn)莫匹羅星的熒光假單胞菌基因工程菌株的制作方法，其特征在于，以具有高產(chǎn)莫匹羅星的熒光假單胞菌(Pseudomonas?fluorescens)2P24為出發(fā)菌株，利用基因重組技術(shù)分別敲除2P24基因組中的spoT基因、relA基因、mvaT基因和rsaL基因，得到高產(chǎn)莫匹羅星的熒光假單胞菌基因工程菌株2P24ΔATTL。
3.如權(quán)利要求2所述的制作方法，其特征在于，spoT基因的具體敲除方式如下：
1)擴增spoT基因上下游片段，通過融合PCR法將spoT基因上下游片段連接并克隆到p2P24Km自殺質(zhì)粒中，得到spoT基因重組質(zhì)粒p2P24-spoT；
2)通過電擊轉(zhuǎn)化將p2P24-spoT導(dǎo)入熒光假單胞菌2P24中；
3)通過蔗糖平板篩選、PCR篩選共同篩選得到工程菌株2P24ΔspoT。
4.如權(quán)利要求3所述的制作方法，其特征在于，spoT基因的序列如SEQ?ID?NO.1所示；
擴增spoT基因上游片段的引物包括spoT-F1和spoT-R1，序列分別如SEQ?ID?NO.2和SEQID?NO.3所示；
擴增spoT基因下游片段的引物包括spoT-F2和spoT-R2，序列分別如SEQ?ID?NO.4和SEQID?NO.5所示；
采用融合PCR法獲得spoT基因上下游融合片段序列如SEQ?ID?NO.6所示。
5.如權(quán)利要求2所述的制作方法，其特征在于，relA基因的具體敲除方式如下：
1)擴增relA基因上下游片段，通過融合PCR法將relA基因上下游片段連接并克隆到p2P24Km自殺質(zhì)粒中，得到relA基因重組質(zhì)粒p2P24-relA；
2)通過電擊轉(zhuǎn)化將p2P24-relA導(dǎo)入熒光假單胞菌2P24ΔspoT中；
3)通過蔗糖平板篩選、PCR篩選共同篩選得到工程菌株2P24ΔspoTΔrelA。
6.如權(quán)利要求5所述的制作方法，其特征在于，relA基因的序列如SEQ?ID?NO.7所示；
擴增relA基因上游片段的引物包括relA-F1和relA-R1，序列分別如SEQ?ID?NO.8和SEQID?NO.9所示；
擴增relA基因下游片段的引物包括relA-F2和relA-R2，序列分別如SEQ?ID?NO.10和SEQ?ID?NO.11所示；
采用融合PCR法獲得relA基因上下游融合片段序列如SEQ?ID?NO.12所示。
7.如權(quán)利要求2所述的制作方法，其特征在于，mvaT基因的具體敲除方式如下：
1)擴增mvaT基因上下游片段，通過融合PCR法將mvaT基因上下游片段連接并克隆到p2P24Km自殺質(zhì)粒中，得到mvaT基因重組質(zhì)粒p2P24-mvaT；
2)通過電擊轉(zhuǎn)化將p2P24-mvaT導(dǎo)入熒光假單胞菌2P24ΔspoTΔrelA中；
3)通過蔗糖平板篩選、PCR篩選共同篩選得到工程菌株
2P24ΔspoTΔrelAΔmvaT。
8.如權(quán)利要求7所述的制作方法，其特征在于，mvaT基因的序列如SEQ?ID?NO.13所示；
擴增mvaT基因上游片段的引物包括mvaT-F1和mvaT-R1，序列分別如SEQ?ID?NO.14和SEQ?ID?NO.15所示；
擴增mvaT基因下游片段的引物包括mvaT-F2和mvaT-R2，序列分別如SEQ?ID?NO.16和SEQ?ID?NO.17所示；
采用融合PCR法獲得mvaT基因上下游融合片段序列如SEQ?ID?NO.18所示。
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