[發(fā)明專利]一種寡核苷酸反相離子對(duì)液相色譜分析方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202310488765.3
• 申請(qǐng)日: 2023-05-04
• 公開（公告）號(hào): CN116466005A
• 公開（公告）日: 2023-07-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 侯麗強(qiáng);劉婷;李澤亞;安婷婷
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 杭州諾泰諾和生物醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類號(hào): G01N30/02
• 分類號(hào): G01N30/02;G01N30/06;G01N30/54;G01N30/74
• 代理公司: 杭州裕陽聯(lián)合專利代理有限公司 33289
• 代理人: 金方瑋

本發(fā)明公開了一種寡核苷酸反相離子對(duì)液相色譜分析方法，包括配制樣品溶液：稱取樣品置于容量瓶中，溶解后定容，得到樣品溶液；配制流動(dòng)相A，流動(dòng)相B與流動(dòng)相C，經(jīng)微孔膜過濾，超聲脫氣后，采用高效液相色譜儀對(duì)樣品溶液進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)寡核苷酸純度；采用面積歸一化法進(jìn)行純度結(jié)果計(jì)算。本發(fā)明采用寡核苷酸反相離子對(duì)液相色譜分析方法色譜條件范圍寬，適用于各類序列和不同長(zhǎng)度的寡核苷酸純度檢測(cè)，可與質(zhì)譜對(duì)接聯(lián)用，快速分析樣品純度和分子量，梯度范圍寬，可以此為基礎(chǔ)，微調(diào)梯度，達(dá)到各類寡核苷酸最佳分離效果，達(dá)到對(duì)寡核苷酸質(zhì)量進(jìn)行有效控制的目的。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分析領(lǐng)域，具體涉及一種寡核苷酸反相離子對(duì)液相色譜分析方法。

背景技術(shù)

寡核苷酸藥物是指含有10～30個(gè)堿基的RNA或DNA分子及其類似物，可以在基因水平上干擾致病蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，從而達(dá)到治療疾病的目的，因此也是近年來藥物研發(fā)領(lǐng)域中的熱點(diǎn)之一。合成寡核苷酸在作為治療劑治療各種疾病(例如癌癥和病毒性疾病)方面的重要性日益突顯。寡核苷酸類藥物包括反義寡核苷酸、小干擾RNA(siRNA)和適配體。反義寡核苷酸和siRNA均通過阻止mRNA翻譯從而阻止蛋白質(zhì)合成。適配體通過形成適配體-蛋白質(zhì)復(fù)合物，從而抑制蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能。

寡核苷酸藥物的分子量較大，通常為6000～8000，在水中幾乎以陰離子形式存在，會(huì)形成一個(gè)負(fù)電荷聚集的分子體。根據(jù)這樣的結(jié)構(gòu)特征，常用的分析方法有反相離子對(duì)色譜、親水色譜、陰離子交換色譜和毛細(xì)管電泳等。其中，反相離子對(duì)色譜具有分離度高、結(jié)果穩(wěn)定、操作簡(jiǎn)便、易與MS檢測(cè)器對(duì)接及可同時(shí)分離N-1雜質(zhì)等優(yōu)勢(shì)。

至今FDA已批準(zhǔn)了數(shù)個(gè)寡核苷酸藥物上市，而處于臨床研發(fā)階段的藥物數(shù)量更多，因此，開展寡核苷酸分析方法的研究工作十分必要和緊迫。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有寡核苷酸純度分析方法研究匱乏，目的在于提供一種寡核苷酸反相離子對(duì)的純度分析方法。實(shí)現(xiàn)以下發(fā)明目的：

采用反相離子對(duì)高效液相色譜法來分析，具有組分峰分離效果好、分辨率高、分析精度高、重現(xiàn)性好，易與MS對(duì)接，操作簡(jiǎn)易等優(yōu)點(diǎn)，達(dá)到對(duì)寡核苷酸質(zhì)量進(jìn)行有效控制的目的。

為解決上述技術(shù)問題，采用以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了一種寡核苷酸反相離子對(duì)液相色譜分析方法，所述寡核苷酸反相離子對(duì)液相色譜分析方法包括：

1)配制樣品溶液：稱取樣品置于容量瓶中，溶解后定容，得到樣品溶液；

2)配制流動(dòng)相A，流動(dòng)相B與流動(dòng)相C，經(jīng)微孔膜過濾，超聲脫氣后，采用高效液相色譜儀對(duì)樣品溶液進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)寡核苷酸純度；

3)采用面積歸一化法進(jìn)行純度結(jié)果計(jì)算。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方案，步驟1)中，所述樣品溶液的濃度為0.8-1.0mg/mL，溶解樣品所用的容積為純化水。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方案，步驟2)中，高效液相色譜儀為Agilent1290超高效液相色譜儀，配紫外檢測(cè)器和全波長(zhǎng)檢測(cè)。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方案，步驟2)中，色譜柱為ThermoScientific^TMDionex^TMDNAPac^TMRP，色譜柱規(guī)格為長(zhǎng)度100mm，內(nèi)徑3.0mm，填料粒徑為4.0μm。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方案，步驟2)中，所述的流動(dòng)相A為20mM?TEAA/100mMHFIP，3％ACN；流動(dòng)相B為20mM?TEAA/100mM?HFIP，12％?ACN，流動(dòng)相C為ACN。