[發明專利]一種寡核苷酸反相離子對液相色譜分析方法

在審

• 申請號: 202310488765.3
• 申請日: 2023-05-04
• 公開（公告）號: CN116466005A
• 公開（公告）日: 2023-07-21
• 發明（設計）人: 侯麗強;劉婷;李澤亞;安婷婷
• 申請（專利權）人: 杭州諾泰諾和生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/54;G01N30/74
• 代理公司: 杭州裕陽聯合專利代理有限公司 33289
• 代理人: 金方瑋

本發明公開了一種寡核苷酸反相離子對液相色譜分析方法，包括配制樣品溶液：稱取樣品置于容量瓶中，溶解后定容，得到樣品溶液；配制流動相A，流動相B與流動相C，經微孔膜過濾，超聲脫氣后，采用高效液相色譜儀對樣品溶液進行檢測，檢測寡核苷酸純度；采用面積歸一化法進行純度結果計算。本發明采用寡核苷酸反相離子對液相色譜分析方法色譜條件范圍寬，適用于各類序列和不同長度的寡核苷酸純度檢測，可與質譜對接聯用，快速分析樣品純度和分子量，梯度范圍寬，可以此為基礎，微調梯度，達到各類寡核苷酸最佳分離效果，達到對寡核苷酸質量進行有效控制的目的。

技術領域

本發明屬于分析領域，具體涉及一種寡核苷酸反相離子對液相色譜分析方法。

背景技術

寡核苷酸藥物是指含有10～30個堿基的RNA或DNA分子及其類似物，可以在基因水平上干擾致病蛋白質的產生，從而達到治療疾病的目的，因此也是近年來藥物研發領域中的熱點之一。合成寡核苷酸在作為治療劑治療各種疾病(例如癌癥和病毒性疾病)方面的重要性日益突顯。寡核苷酸類藥物包括反義寡核苷酸、小干擾RNA(siRNA)和適配體。反義寡核苷酸和siRNA均通過阻止mRNA翻譯從而阻止蛋白質合成。適配體通過形成適配體-蛋白質復合物，從而抑制蛋白質的生物學功能。

寡核苷酸藥物的分子量較大，通常為6000～8000，在水中幾乎以陰離子形式存在，會形成一個負電荷聚集的分子體。根據這樣的結構特征，常用的分析方法有反相離子對色譜、親水色譜、陰離子交換色譜和毛細管電泳等。其中，反相離子對色譜具有分離度高、結果穩定、操作簡便、易與MS檢測器對接及可同時分離N-1雜質等優勢。

至今FDA已批準了數個寡核苷酸藥物上市，而處于臨床研發階段的藥物數量更多，因此，開展寡核苷酸分析方法的研究工作十分必要和緊迫。

發明內容

本發明針對現有寡核苷酸純度分析方法研究匱乏，目的在于提供一種寡核苷酸反相離子對的純度分析方法。實現以下發明目的：

采用反相離子對高效液相色譜法來分析，具有組分峰分離效果好、分辨率高、分析精度高、重現性好，易與MS對接，操作簡易等優點，達到對寡核苷酸質量進行有效控制的目的。

為解決上述技術問題，采用以下技術方案：

本發明提供了一種寡核苷酸反相離子對液相色譜分析方法，所述寡核苷酸反相離子對液相色譜分析方法包括：

1)配制樣品溶液：稱取樣品置于容量瓶中，溶解后定容，得到樣品溶液；

2)配制流動相A，流動相B與流動相C，經微孔膜過濾，超聲脫氣后，采用高效液相色譜儀對樣品溶液進行檢測，檢測寡核苷酸純度；

3)采用面積歸一化法進行純度結果計算。

作為本發明的一種優選方案，步驟1)中，所述樣品溶液的濃度為0.8-1.0mg/mL，溶解樣品所用的容積為純化水。

作為本發明的一種優選方案，步驟2)中，高效液相色譜儀為Agilent1290超高效液相色譜儀，配紫外檢測器和全波長檢測。

作為本發明的一種優選方案，步驟2)中，色譜柱為ThermoScientific^TMDionex^TMDNAPac^TMRP，色譜柱規格為長度100mm，內徑3.0mm，填料粒徑為4.0μm。

作為本發明的一種優選方案，步驟2)中，所述的流動相A為20mM?TEAA/100mMHFIP，3％ACN；流動相B為20mM?TEAA/100mM?HFIP，12％?ACN，流動相C為ACN。