[發(fā)明專利]十二指腸賈第蟲CP1、CP2基因的間接ELISA檢測方法及試劑盒

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202310478176.7
• 申請日: 2023-04-28
• 公開（公告）號: CN116626292A
• 公開（公告）日: 2023-08-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 董海聚;陳明輝;劉芳;代宏宇;王步康;汪海東;眭玉珍;左守軍;宋鵬濤;栗亮亮
• 申請（專利權(quán)）人: 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/535
• 代理公司: 佛山知正知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 44483
• 代理人: 王海燕

本發(fā)明基于十二指腸賈第蟲CP1、CP2蛋白基因構(gòu)建pET?32a?CP1、pET?32a?CP2表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)入Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)利用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS?PAGE檢測分析重組蛋白的表達(dá)形式后采用Ni?NTA親和層析法對其進(jìn)行純化，并以此為包被抗原建立了兩種間接ELISA方法。本發(fā)明基于重組蛋白CP1、CP2建立的間接ELISA方法具有良好的特異性，敏感性和重復(fù)性，與顯微鏡檢測結(jié)果的符合率分別為98％和94％。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及十二指腸賈第蟲CP1、CP2基因的表達(dá)載體及間接ELISA方法的建立，以及檢測試劑盒。

背景技術(shù)

賈第鞭毛蟲病是全球最流行的腸道寄生蟲病之一，其罪魁禍?zhǔn)资且约S-口為傳播途徑的肉鞭門，動鞭綱，雙滴蟲目，六鞭科的賈第蟲屬。該病的癥狀主要有以由腹瀉引起的生長不良、體重減輕、生產(chǎn)力下降為主，腸外并發(fā)癥還包括認(rèn)知功能低下、眼部病變、關(guān)節(jié)炎、過敏、低血鉀性肌病、癌癥等。據(jù)統(tǒng)計，每年約有1.84億人受到影響，約10億人面臨疾病風(fēng)險；在某些發(fā)展中國家，甚至超過30％的人受到感染。2004年，賈第鞭毛蟲與隱孢子蟲一起被列入世衛(wèi)組織被忽視的疾病倡議。目前該病沒有疫苗，但甲硝銼對其的有較好的治療效果。

賈第蟲的生活史較為簡單，僅有包囊和滋養(yǎng)體兩種形態(tài)。包囊隨著宿主的糞便脫落，該形態(tài)有一層較厚的囊壁，對各種消毒劑(如氯)的滅活具有中等的抵抗力，并且對環(huán)境穩(wěn)定，可以在水中或在陰涼潮濕的環(huán)境保持幾個月的傳染性，最小感染量被認(rèn)為最低可至10個包囊。當(dāng)宿主攝入賈第蟲包囊后，包囊在十二指腸脫囊形成滋養(yǎng)體，營縱二分裂法繁殖，若滋養(yǎng)體落入腸腔到達(dá)回腸下段或結(jié)腸腔后，就會形成包囊，隨糞便排出體外，開始新一輪的感染周期。

賈第蟲通過糞-口途徑傳播。水源性傳播是目前公認(rèn)的最廣泛的傳播途徑，在一項1971-2011年向疾病控制和預(yù)防中心報告的所有賈第鞭毛蟲病爆發(fā)的數(shù)據(jù)分析中顯示，水傳播、食源性傳播、人-人傳播和人-動物動物傳播的占比分別為74.8％、15.7％、2.5％和1.2％。雖然食源性傳播比其他途徑要少得多，但也不容小覷，在一項全球食源性寄生蟲的重要性排名中賈第鞭毛蟲病位居第11位，據(jù)估計，美國國內(nèi)的賈第鞭毛蟲病病例中有7％-15％是食源性導(dǎo)致的，在各種食品中均檢測到過賈第鞭毛蟲包囊的存在，如新鮮農(nóng)產(chǎn)品(綠葉蔬菜、草藥、漿果、大蔥、胡蘿卜、西紅柿等等)、乳制品、肉類、貝類和加工食品。昆蟲在一些特殊情況下也能成為傳播媒介，賈第蟲包囊在部分蜱蟲體內(nèi)可存活3-4天，在蟑螂體內(nèi)可存活約10天。除此之外，性傳播曾導(dǎo)致過其在同性戀男子中的爆發(fā)，在一個發(fā)達(dá)國家，高達(dá)12％的病例是由性傳播引起。

目前確診賈第蟲感染的“金標(biāo)準(zhǔn)”仍是顯微鏡檢查，但該方法耗時耗力、主觀性強、需要大量專業(yè)知識，檢出率低，敏感性低，在感染率低時極易出現(xiàn)漏檢，所以越來越多免疫學(xué)檢測方法被推廣，而其中的ELISA具有特異性強、操作簡單、易于群檢等特點脫穎而出。雖然目前已有多種賈第蟲病免疫學(xué)診斷商用試劑盒面市，但仍存在一些問題：一是大多為進(jìn)口產(chǎn)品且價格較高，國內(nèi)市場難以流通；二是在檢測抗體時，難以區(qū)分現(xiàn)癥感染和既往感染；三是檢測糞便樣本時，對抗原要求較高，且難以區(qū)分包囊活性；四是各免疫診斷技術(shù)有差異性較大和穩(wěn)定性不夠的問題，實際應(yīng)用中還需加強技術(shù)改進(jìn)和標(biāo)準(zhǔn)化。一旦疫情爆發(fā)或流行，該檢測方法也無法滿足短時間內(nèi)對大量樣本進(jìn)行檢測的需求。相比之下，免疫學(xué)檢測方法特異性好，敏感性高，操作簡單，易于推廣，展現(xiàn)出了良好的應(yīng)用和發(fā)展前景。然而，現(xiàn)有技術(shù)中尚無針對十二指腸賈第蟲的免疫學(xué)檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供十二指腸賈第蟲CP1、CP2基因的表達(dá)載體，并建立間接ELISA方法，為膠體金試紙條的進(jìn)一步開發(fā)開拓思路。

在一個方面，本發(fā)明提供了十二指腸賈第蟲CP1或CP2基因的間接ELISA檢測試劑盒，所述試劑盒中包含重組蛋白CP1多克隆抗體或重組蛋白CP2多克隆抗體作為一抗。