[發(fā)明專利]十二指腸賈第蟲CP1、CP2基因的間接ELISA檢測(cè)方法及試劑盒

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202310478176.7
• 申請(qǐng)日: 2023-04-28
• 公開（公告）號(hào): CN116626292A
• 公開（公告）日: 2023-08-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 董海聚;陳明輝;劉芳;代宏宇;王步康;汪海東;眭玉珍;左守軍;宋鵬濤;栗亮亮
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N33/569
• 分類號(hào): G01N33/569;G01N33/535
• 代理公司: 佛山知正知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 44483
• 代理人: 王海燕

1.十二指腸賈第蟲CP1或CP2基因的間接ELISA檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒中包含重組蛋白CP1多克隆抗體或重組蛋白CP2多克隆抗體作為一抗。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的間接ELISA檢測(cè)試劑盒，其中，使用間接ELISA法檢測(cè)效價(jià)，所述重組蛋白CP1多克隆抗體、重組蛋白CP2多克隆抗體的效價(jià)在128000以上。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的間接ELISA檢測(cè)試劑盒，其中，所述重組蛋白CP1多克隆抗體或重組蛋白CP2多克隆抗體通過將CP1或CP2基因的重組蛋白作為抗原對(duì)新西蘭大白兔按照免疫程序進(jìn)行免疫，ELISA法檢測(cè)效價(jià)合格后頸動(dòng)脈采血制備獲得。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的間接ELISA檢測(cè)試劑盒，其中，所述CP1或CP2基因的重組蛋白通過如下方法制備：

將CP1或CP2特異性引物以提取賈第蟲滋養(yǎng)體總基因組為模板進(jìn)行擴(kuò)增，獲得CP1、CP2基因，將其分別與克隆載體pMD18-T進(jìn)行連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18-T-CP1、pMD18-T-CP2；

將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pMD18-T-CP1、pMD18-T-CP2轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α擴(kuò)大培養(yǎng)，對(duì)測(cè)序結(jié)果正確的pMD18-T-CP1、pMD18-T-CP2克隆載體與pET-32a(+)載體建立雙酶切反應(yīng)，將酶切后的CP1、CP2基因與酶切后的pET-32a(+)載體進(jìn)行連接，制備得到pET-32a-CP1、pET-32a-CP2重組表達(dá)質(zhì)粒；

將上述pET-32a-CP1、pET-32a-CP2重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，利用IPTG誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)，純化得到CP1或CP2的重組蛋白。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的間接ELISA檢測(cè)試劑盒，其中，所述CP1基因的特異性引物的序列如SEQ?ID?NO.1、SEQ?ID?NO.2所示；所述CP2基因的特異性引物的序列如SEQ?ID?NO.3、SEQ?ID?NO.4所示。

6.十二指腸賈第蟲CP1或CP2基因的間接ELISA檢測(cè)方法，所述方法包括：

(1)準(zhǔn)備工作：裂解待檢樣品，離心，上清液轉(zhuǎn)移至新的無菌離心管，加入10μL蛋白酶抑制劑，得到裂解液；

(2)抗原包被：每孔分別加入100μL上述裂解液，4℃包被過夜；

(3)洗滌：棄掉孔內(nèi)液體，PBST清洗，震蕩后在吸水紙上拍干；

(4)封閉：每孔加入200μL封閉液，37℃封閉1h，然后重復(fù)步驟(3)；

(5)一抗孵育：采用重組蛋白CP1多克隆抗體或重組蛋白CP2多克隆抗體作為一抗，使用一抗稀釋液對(duì)血清進(jìn)行稀釋；酶標(biāo)板每孔加100μL各稀釋倍數(shù)的血清；37℃孵育，然后重復(fù)步驟(3)；

(6)二抗孵育：將辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG在二抗稀釋液中稀釋，每孔加入100mL，室溫下分別孵育，然后重復(fù)步驟(3)；

(7)反應(yīng)：每孔加入100μL?TMB底物溶液進(jìn)行顯色反應(yīng)，37℃孵育15min；

(8)OD值測(cè)定：每孔使用50μL?ELISA終止反應(yīng)液，30min內(nèi)用酶標(biāo)儀讀取OD450數(shù)值，P值(待見樣品OD值：陰性對(duì)照OD值)2.1判定為陽(yáng)性。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的間接ELISA檢測(cè)方法，其中，步驟(2)中，抗原包被量為0.25ug/mL。

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的間接ELISA檢測(cè)方法，其中，當(dāng)使用重組蛋白CP1單克隆抗體作為一抗時(shí)，步驟(5)中的一抗稀釋倍數(shù)為1600，一抗孵育時(shí)間為1h；步驟(6)中的二抗稀釋倍數(shù)為20000，二抗孵育時(shí)間為1h。

9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的間接ELISA檢測(cè)方法，其中，當(dāng)使用重組蛋白CP2單克隆抗體作為一抗時(shí)，步驟(5)中的一抗稀釋倍數(shù)為3200，一抗孵育時(shí)間為1.5h；步驟(6)中的二抗稀釋倍數(shù)為20000，二抗孵育時(shí)間為1h。

10.十二指腸賈第蟲的檢測(cè)方法，所述方法包括：

使用權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的間接ELISA檢測(cè)試劑盒，或采用權(quán)利要求6-9中任一項(xiàng)所述的間接ELISA檢測(cè)方法，記錄CP1、CP2蛋白陰性血清樣本的OD450，計(jì)算出組內(nèi)平均值(AV)和標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，計(jì)算出AV+3×SD值為陽(yáng)性臨界值，計(jì)算AV+2×SD值為陰性臨界值，兩者之間為可疑值，需要重新檢測(cè)。