[發明專利]一種BNP兔單克隆抗體的制備方法

在審

• 申請號: 202310478167.8
• 申請日: 2023-04-28
• 公開（公告）號: CN116375863A
• 公開（公告）日: 2023-07-04
• 發明（設計）人: 陳玲;張宇;蘇恩本;嚴行波;張盼盼
• 申請（專利權）人: 東南大學;基蛋生物科技股份有限公司
• 主分類號: C07K16/26
• 分類號: C07K16/26;C12N15/85
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明涉及一種BNP兔單克隆抗體的制備方法，包括如下步驟：通過抗原對免疫調節劑脂質體處理后的兔子進行免疫；取免疫后兔子的脾臟細胞分離出的B細胞與骨髓瘤細胞進行融合；篩選產生抗BNP抗體的優勢兔鼠雜交瘤細胞株；根據篩選出的優勢兔鼠雜交瘤細胞株為模板對抗體中重鏈、輕鏈可變區進行RT?PCR擴增，得到多個重鏈、輕鏈可變區基因；將重鏈、輕鏈可變區基因分別通過同源重組克隆到含恒定區基因的pcDNA?R1表達載體中，轉染到HEK293T細胞中進行表達，得BNP兔單克隆抗體。利用兔抗體形成過程中的基因轉換特性，將免疫調節劑脂質體用于早期兔免疫細胞分化成熟過程，促進兔免疫系統初始B細胞的分化，產生更多樣化的B細胞，在后期免疫反應過程中獲得高質量的抗體。

技術領域

本發明涉及免疫學技術領域，具體涉及一種BNP兔單克隆抗體的制備方法。

背景技術

B型腦鈉肽（BNP），主要是由心室分泌，在心室舒張末壓增高、心室壁張力增加的時候分泌會增加，它的主要作用是利鈉、利水，而心衰病人由于左室舒張末期壓力明顯增高，室壁張力增加，BNP會隨之增加。BNP是臨床上用作心衰的一個重要的指標，左室舒張末期壓力增加說明心衰的存在，無論是收縮還是舒張功能障礙，都會出現BNP的增加，而且心功能障礙越明顯，BNP的增加就會越明顯。

ProBNP是BNP的前體，一旦從心臟釋放到血液中，proBNP就會分割為NT-proBNP和BNP。BNP是一種有生物活性的蛋白質，與BNP相反，NT-proBNP生物學上不活躍，這意味著NT-proBNP能追溯更長的時間保持不變，可對其進行長時間跟蹤，使用簡便高效。由于NT-proBNP的半衰期為60至120分鐘，可追蹤的時間多達24小時，相比之下，BNP的半衰期僅20分鐘至1小時，其最多可監測的時間僅1小時。由于半衰期長，因此NT-proBNP檢測提供了更高的靈敏度，以便臨床醫生可以準確發現早期的和輕度的心力衰竭。而BNP在治療12小時后就產生明顯的降低，而NT-proBNP在24h前都是升高的，在24小時到出院都是降低的，但降低幅度沒有BNP明顯。因此，BNP反應更為敏銳，利于動態監測病人的治療效果。

臨床快速檢測BNP主要是通過免疫層析法進行，該方法通過雙抗體夾心對血清樣本中BNP進行檢測，因此該檢測試劑的性能與使用的抗體的性能密切相關，由于BNP分子較小，僅32個氨基酸，小鼠對于類似小分子產生的抗體多樣性十分有限，很難篩選到高質量的抗體。

發明內容

本發明克服了現有技術中的不足，在于提供一種能夠使動物產生更多樣化的抗體，有助于在后期免疫反應過程中獲得高質量的BNP兔單克隆抗體的制備方法。

本發明的具體技術方案如下：

一種BNP兔單克隆抗體的制備方法，包括如下步驟：

通過抗原對免疫調節劑脂質體處理后的兔子進行免疫；

取免疫后兔子的脾臟細胞；

將脾臟細胞分離出的B細胞與骨髓瘤細胞進行融合；

篩選產生抗BNP抗體的優勢兔鼠雜交瘤細胞株；

根據篩選出的優勢兔鼠雜交瘤細胞株產生的抗體提取抗BNP抗體的RNA；

以該RNA為模板對抗體中重鏈、輕鏈可變區進行RT-PCR擴增，得到多個重鏈和輕鏈可變區基因；

將重鏈、輕鏈可變區基因分別通過同源重組克隆到含重鏈、輕鏈恒定區基因的pcDNA-R1表達載體中，轉染到HEK293T細胞中進行表達，得BNP兔單克隆抗體。

優選的，通過抗原對免疫調節劑處理后的兔子進行免疫，包括：以純化的人BNP融合蛋白為抗原對兔子進行免疫處理，免疫處理前采用組蛋白去乙?；敢种苿┨幚硗米印?/p>

優選的，所述組蛋白去乙?；敢种苿镾AHA脂質體。

優選的，所述SAHA脂質體的粒徑為120～180nm，SAHA脂質體是由SAHA包載到脂質體DSPE-PEG2000的親水性囊包中制備成的。