[發(fā)明專利]一種BNP兔單克隆抗體的制備方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202310478167.8
• 申請日: 2023-04-28
• 公開（公告）號: CN116375863A
• 公開（公告）日: 2023-07-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳玲;張宇;蘇恩本;嚴(yán)行波;張盼盼
• 申請（專利權(quán)）人: 東南大學(xué);基蛋生物科技股份有限公司
• 主分類號: C07K16/26
• 分類號: C07K16/26;C12N15/85
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1.一種BNP兔單克隆抗體的制備方法，其特征在于包括如下步驟：

通過抗原對免疫調(diào)節(jié)劑脂質(zhì)體處理后的兔子進(jìn)行免疫；

取免疫后兔子的脾臟細(xì)胞；

將脾臟細(xì)胞分離出的B細(xì)胞漿細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合；

篩選產(chǎn)生抗BNP抗體的優(yōu)勢兔鼠雜交瘤細(xì)胞株；

根據(jù)篩選出的優(yōu)勢兔鼠雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生的抗體提取抗BNP抗體的RNA；

以該RNA為模板對抗體中重鏈、輕鏈可變區(qū)進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，得到多個重鏈和輕鏈可變區(qū)基因；

將重鏈、輕鏈可變區(qū)基因分別通過同源重組克隆到含重鏈、輕鏈恒定區(qū)基因的pcDNA-R1表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，得BNP兔單克隆抗體。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，通過抗原對免疫調(diào)節(jié)劑處理后的兔子進(jìn)行免疫，包括：以純化的人BNP融合蛋白為抗原對兔子進(jìn)行免疫處理，免疫處理前采用組蛋白去乙酰化酶抑制劑處理兔子。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述組蛋白去乙酰化酶抑制劑為SAHA脂質(zhì)體。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述SAHA脂質(zhì)體的粒徑為120～180nm，SAHA脂質(zhì)體是由SAHA包載到脂質(zhì)體DSPE-PEG2000的親水性囊包中制備成的。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，將脾臟細(xì)胞分離出的B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，包括：從獲取免疫后的兔脾臟細(xì)胞分離出B細(xì)胞，使用抗兔CD138抗體對B細(xì)胞進(jìn)行漿細(xì)胞篩選富集；將小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0擴(kuò)大培養(yǎng)使之處于對數(shù)生長期，取SP2/0細(xì)胞和漿細(xì)胞進(jìn)行電擊融合得到兔鼠雜交瘤細(xì)胞。

6.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的制備方法，其特征在于，篩選產(chǎn)生抗BNP抗體的優(yōu)勢兔鼠雜交瘤細(xì)胞株，包括：兔鼠雜交瘤細(xì)胞加入DMEM培養(yǎng)基中，待細(xì)胞狀態(tài)恢復(fù)后，加入含BALB/c小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的HAT培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，待融合細(xì)胞成團(tuán)時將單細(xì)胞克隆挑至鋪有BALB/c小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的HT培養(yǎng)液中培養(yǎng)，采用間接ELISA法篩選產(chǎn)生抗BNP抗體的優(yōu)勢雜交瘤細(xì)胞株。

7.?根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，以該RNA為模板對抗體中重鏈、輕鏈可變區(qū)進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增時，采用的重鏈可變區(qū)引物基因序列分別如下：

SEQ?ID?NO.01（HC-F1）：GTCGBTGRAGGAGTCCG

SEQ?ID?NO.02（HC-F2）：GGAGCAGYTGAAGGAGTC

SEQ?ID?NO.03（HC-F3）：GCAGCTGGAGCAGTCCG

SEQ?ID?NO.04（HC-G-F1）：ATGGAGACTGGGCTGCGCTGG

SEQ?ID?NO.05（HC-G-R1）：AGATCATGAGGGTGTCCTTG

SEQ?ID?NO.06（HC-G-R2）：GTGGGCACGTGGGCTTGCTG

SEQ?ID?NO.07（HC-M-R1）：GGGAAAGGACACTCGCA

SEQ?ID?NO.08（HC-M-R2）：GGACTTGCGTGTGCCAGA。