[發明專利]一種用于半胱氨酸和microRNA生物標志物的檢測方法及應用

在審

• 申請號: 202310470298.1
• 申請日: 2023-04-27
• 公開（公告）號: CN116496775A
• 公開（公告）日: 2023-07-28
• 發明（設計）人: 于快;周燕;王燁菲;曹君如;葉陳對;章弘揚;胡坪;張敏
• 申請（專利權）人: 華東理工大學
• 主分類號: C09K11/02
• 分類號: C09K11/02;G01N33/68;G01N33/533;C12Q1/6806;C12Q1/682;G01N21/64;C09K11/58;B82Y20/00;B82Y30/00
• 代理公司: 上海三和萬國知識產權代理事務所(普通合伙) 31230
• 代理人: 陶芾

本發明公開了一種用于半胱氨酸和microRNA的金納米簇(AuNCs)熒光探針檢測方法，分別制備適合于兩者的DNA@AuNCs，將Cys和miRNA溶液分別加入至DNA@AuNCs熒光探針中，混合均勻。將混合溶液置于36?38℃金屬浴中孵育0.5?1.5h。測定所得溶液在400～750nm范圍內的熒光發射光譜。用熒光法檢測不同濃度的Cys和miRNA標準溶液所對應的熒光強度F，以系列Cys和miRNA標準溶液的濃度為橫坐標，相對熒光強度(F?F0)/F0為縱坐標，繪制濃度?熒光強度工作曲線，擬合線性回歸方程。將含有Cys或miRNA的樣品溶液加入熒光探針中，測定其在特定波長下的熒光強度，將強度值代入工作曲線，計算得到Cys或miRNA的濃度。本發明解決了現有方法耗時較長、誤差較大、測試方法繁瑣等問題，是一種簡便、快速、高靈敏度的檢測方法。

技術領域

本發明屬于生物傳感技術領域，具體涉及一種半胱氨酸和microRNA含量檢測方法。

背景技術

半胱氨酸(Cys)是一種生物體內重要的氨基酸，其對人體正常的生理功能非常重要，參與細胞的還原過程和體內肽和蛋白質的合成，還可以用于氨基酸類解毒藥。生物體內Cys的含量異常常與多種疾病的發生和發展密切相關。Cys的缺乏會導致生物體造血功能下降，產生水腫、肝損傷等不良影響，但過量的Cys也會導致多種神經系統疾病的發生，如阿爾茨海默氏病。因此，Cys含量的準確和快速測定對于相關疾病的早期診斷及預后評估非常重要。

MicroRNA(miRNA)是一類包含在生物體內的非編碼RNA，通常由20-24個核苷酸組成，在生物體內參與基因表達的調節及多個生理過程的控制，如細胞分化調節、增殖、代謝、凋亡以及免疫等過程。miRNA的異常表達與多種生理功能異常或疾病的發生發展有著密切的聯系。當前，多種miRNA已被用于疾病早期診斷的生物標志物，如miR-21、miR-26a、miR-27a、miR-122、miR-192、miR-223、miR-801等。在多種癌癥病變組織中，均發現不同種miRNA過度表達的現象，如胃癌、肝癌、乳腺癌、肺癌等。

當前，已有多種方法應用于Cys和micro?RNA的含量測定，如高效液相色譜法、毛細管電泳法、電化學法、質譜法和熒光光譜法等。上述儀器分析法不僅需要昂貴的儀器，還需要復雜的樣品前處理及準備工作，而熒光光譜法具有靈敏度高，樣品預處理簡單等優勢，有望應用于實際樣品中Cys和micro?RNA的快速檢測。

發明內容

因此，為了克服現有技術手段中存在的缺點，如測試時間較長、誤差較大、測試過程繁瑣等問題，本發明要解決的技術問題是，開發一種簡便、快速且靈敏度高的生物傳感方法，用于半胱氨酸和miRNA的檢測。

本發明的技術方案是，

一種用于半胱氨酸的檢測的DNA@AuNCs的合成方法，包括DNA@AuNCs的合成：

a、將鏈長為15-30的聚核苷酸配制成10-200μM的儲備液，按照3-4:1-2體積比與HAuCl₄溶液混合，攪拌混勻，得到混合溶液；

b、向混合溶液中加入100-400mM檸檬酸鈉溶液，并混合均勻；然后將所得溶液在室溫黑暗中放置12-36h以促進AuNCs的形成，得到DNA@AuNCs。

合成后的DNA@AuNCs在使用前存儲在4℃下。

根據本發明的一種用于半胱氨酸檢測的DNA@AuNCs的合成方法，優選的是，步驟a所述聚核苷酸溶液和氯金酸溶液的體積比是3-4:1；步驟a所述攪拌為磁力攪拌。優選的是，步驟a所述的氯金酸溶液的濃度是0.5-5mM。

根據本發明的一種用于半胱氨酸檢測的DNA@AuNCs的合成方法，優選的是，步驟b所述檸檬酸鈉溶液濃度為100-200mM。

本發明還提供了上述方法得到的DNA@AuNCs體系在Cys定量檢測方面的應用，