[發明專利]一種具有抗氧化活性黑果枸杞籽提取物制備及主要活性成分鑒定方法

在審

• 申請號: 202310459054.3
• 申請日: 2023-04-26
• 公開（公告）號: CN116559320A
• 公開（公告）日: 2023-08-08
• 發明（設計）人: 梁現蕊;葉琴
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;A23L33/105;B01D11/02;B01D3/08;G01N30/06;G01N30/14;G01N30/72;A61K36/815;A61P39/06;A61K131/00
• 代理公司: 杭州浙科專利事務所(普通合伙) 33213
• 代理人: 龔如朝

1.一種具有抗氧化活性黑果枸杞籽提取物制備及主要活性成分鑒定方法，其中，提取物制備及活性成分鑒定包括以下步驟：

1)將黑果枸杞籽干燥后研磨，過篩，得黑果枸杞籽粉末；

2)將步驟1)所得干燥的黑果枸杞籽粉末為原料，與提取溶劑以1g:5～40mL的料液比混合，然后超聲提取10～50min，重復提取3次，合并上清液，離心，上清液經旋轉蒸發除去溶劑，最后放入冷凍干燥機中冷凍干燥得到黑果枸杞籽提取物；

3)將步驟2)所得黑果枸杞籽提取物進行2,2-二苯基-1-三硝基肼DPPH抗氧化活性測試；

4)將步驟2)所得黑果枸杞籽提取物經超高效液相色譜UPLC分析，得UPLC色譜圖；采用離線DPPH-UPLC聯用技術法，對步驟2)所得黑果枸杞籽提取物中的抗氧化活性成分進行分析，確定具有抗氧化活性的目標峰；

5)進一步采用超高效液相色譜-串聯四極桿飛行時間質譜UPLC-QTOF-MS/MS法對提取物中的抗氧化活性成分進行鑒定，確定步驟4)中抗氧化活性目標峰所對應的分子結構。

2.如權利要求1所述的一種具有抗氧化活性黑果枸杞籽提取物制備及主要活性成分鑒定方法，其特征在于：步驟2)所述提取溶劑為丙酮和水的混合溶劑，混合溶劑中丙酮的體積分數為70％；黑果枸杞籽粉末與提取溶劑的料液比為1g:10mL，超聲提取溫度為25-35℃，超聲提取時間為30min。

3.如權利要求1所述的一種具有抗氧化活性黑果枸杞籽提取物制備及主要活性成分鑒定方法，其特征在于：步驟3)采用DPPH，對黑果枸杞籽提取物進行抗氧化活性測試，且提取物在31.25-1000.0μg/mL的溶液濃度范圍內與0.2mMDPPH自由基溶液以1:1的體積比混合測定時，黑果枸杞籽提取物清除DPPH自由基的能力隨濃度增大而增強，清除率由32.85％升至92.38％。

4.如權利要求1所述的一種具有抗氧化活性黑果枸杞籽提取物制備及主要活性成分鑒定方法，其特征在于：步驟4)所述黑果枸杞籽提取物的超高效液相色譜分析條件為：流動相A為0.3％甲酸水溶液，流動相B為乙腈，流動相流速0.3mL/min；采用梯度洗脫的方式，具體為：0～18min，95％～56％A；18～20min，56％～10％A；20～30min，10％～95％A；柱溫：35℃；檢測波長：280nm；進樣量：3μL，進樣濃度：12mg/mL。

5.如權利要求1所述的一種具有抗氧化活性黑果枸杞籽提取物制備及主要活性成分鑒定方法，其特征在于：步驟4)所述離線DPPH-UPLC聯用技術法，樣品進樣濃度為1mg/mL；測試過程為：將步驟2)所得黑果枸杞籽提取物用體積分數70％甲醇水溶液溶解后分為等量兩部分，一部分樣品溶液與DPPH自由基溶液混合后采用UPLC進行檢測獲得樣品組色譜圖，另一部分樣品溶液與體積分數70％甲醇水溶液混合后采用UPLC進行檢測獲得對照組色譜圖，將樣品組色譜圖與對照組色譜圖進行對比，樣品組色譜圖峰面積減少或消失的峰代表的化合物即為具有抗氧化活性化合物。

6.如權利要求1所述的一種具有抗氧化活性黑果枸杞籽提取物制備及主要活性成分鑒定方法，其特征在于：步驟5)所述UPLC-QTOF-MS/MS法質譜條件為：離子源：ESI；質譜方法：毛細管電壓：4500V；霧化器氣體(N₂)壓力為0.3bar；干燥氣N₂流速為4.0L/min；干燥氣溫度為220℃；數據采集方式：正負離子模式；分子量范圍：m/z50～1500。

7.如權利要求1所述的一種具有抗氧化活性黑果枸杞籽提取物制備及主要活性成分鑒定方法，其特征在于：步驟5)鑒定出3種主要的抗氧化活性成分，分別為N¹-caffeoyl,N¹⁰-dihydrocaffeoylspermidine；N¹-dihydrocaffeoyl,N¹⁰-caffeoylspermidine和N,N-dicaffeoyl-spermidine，將它們分別記為化合物1、化合物2和化合物3：

所述化學成分的結構式依次為：