[發明專利]B族鏈球菌16S rRNA的RT-PCR檢測引物及其探針、試劑盒、應用

在審

• 申請號: 202310435699.3
• 申請日: 2023-04-21
• 公開（公告）號: CN116590439A
• 公開（公告）日: 2023-08-15
• 發明（設計）人: 康怡;牛春梅;趙思軍;張珂
• 申請（專利權）人: 四川恒元信生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12N15/11;C12Q1/686;C12R1/46
• 代理公司: 北京云嘉湃富知識產權代理有限公司 11678
• 代理人: 劉士暢

本發明公開了一組B族鏈球菌16S?rRNA的RT?PCR檢測引物及其探針、試劑盒、應用，涉及RT?PCR檢測技術領域。包括用于擴增檢測GBS?16s?rRNA的上下游引物對GBS?16s?F和GBS?16s?R，內參引物對interior?F和interior?R，對應的探針包括GBS?16s?rRNA檢測探針GBS?16s?P和內參探針interior?P。本發明提供的試劑盒能實現對樣品RNA特異性和高靈敏度檢測，以供臨床研究使用，可用于B族鏈球菌的普查和預防。

技術領域

本發明涉及RT-PCR檢測技術領域，具體涉及一組B族鏈球菌16S?rRNA的RT-PCR檢測引物及其探針、試劑盒、應用。

背景技術

B族鏈球菌(group?B?streptococcus,GBS)，又名無乳鏈球菌，屬于需氧革蘭陽性鏈球菌。B族鏈球菌正常寄居于陰道和直腸，為條件致病菌，定植于產婦生殖道的B族鏈球菌，可在分娩時垂直傳播給新生兒，而新生兒GBS感染所引起的新生兒敗血癥、腦膜炎和肺炎等癥致死率極高，并可導致神經系統后遺癥。目前，GBS已被證實為圍產期母嬰感染的主要致病菌之一，在圍產醫學中占有不可忽視的地位，同時它也是嬰幼兒敗血癥和腦膜炎最常見的原因。2010年美國疾病預防中心制定了《圍產期GBS預防指南》，建議孕婦在妊娠35～37周進行GBS篩查。

目前，對B族鏈球菌的檢測方法較多，常見的檢測方法有：細菌培養法、膠體金檢測抗體法、PCR檢測DNA等。細菌培養法操作復雜，所需的時間長，通常為24～72小時，不能滿足臨床需求。膠體金法一般為定性或半定量，在靈敏度和準確性上有很大局限性。伴隨核酸熒光標記技術不斷進步，傳統PCR技術結合光譜技術發展起來了一種更靈敏、更特異、更精確的核酸檢測技術，即熒光定量PCR技術。該方法檢測結果準確，重復性高，污染率低，在B族鏈球菌的臨床診斷中通常都會借助熒光定量PCR技術進行輔助檢測。但是，現有熒光定量PCR技術仍然存在假陽性、準確性和穩定性低、靈敏度低等不足，限制了其在臨床上的應用。此外，現有PCR方法一般對GBS?DNA進行檢測，而在DNA中包括有一些已凋亡的細胞和死亡的病原體，不能準確的反映孕婦或新生兒感染B族鏈球菌的真實狀況，有時還會出現假陽性結果，不能很好地指導臨床用藥，限制其在臨床中的應用。

發明內容

針對現有技術中的上述問題，本發明提供一組B族鏈球菌16S?rRNA的RT-PCR檢測引物及其探針、試劑盒、應用，通過檢測B族鏈球菌RNA，既可作為早期診斷的實驗指標,又可同時反映B族鏈球菌在體內活躍繁殖的狀況，更具有臨床價值,為指導臨床醫生治療病人提供強有力的實驗依據，以解決現有技術因為DNA中包括有一些已凋亡的細胞和死亡的病原體而不能準確的反映孕婦或新生兒感染B族鏈球菌的真實狀況的技術難題。

本發明采用的技術方案如下：

B族鏈球菌16S?rRNA的RT-PCR檢測引物，包括用于擴增檢測GBS?16s?rRNA的上下游引物對GBS-16s-F和GBS-16s-R，內參引物對interior-F和interior-R，所述GBS-16s-F、GBS-16s-R、interior-F、interior-R的核苷酸序列分別依次如SEQ?ID?NO:1～SEQ?ID?NO:4所示。

具體序列為：

GBS-16S-F：5’-TTGACATCCTTCTGACCGGC-3’；

GBS-16S-R：5’-AGTCTCGCTAGAGTGCCCAAC-3’；

Interior-F：5’-CAGAGGCAACGACAGGGTAA-3’；

Interior-R：5’-TCTACTTCAGGAAGGCGATGT-3’。