[發明專利]B族鏈球菌16S rRNA的RT-PCR檢測引物及其探針、試劑盒、應用

在審

• 申請號: 202310435699.3
• 申請日: 2023-04-21
• 公開（公告）號: CN116590439A
• 公開（公告）日: 2023-08-15
• 發明（設計）人: 康怡;牛春梅;趙思軍;張珂
• 申請（專利權）人: 四川恒元信生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12N15/11;C12Q1/686;C12R1/46
• 代理公司: 北京云嘉湃富知識產權代理有限公司 11678
• 代理人: 劉士暢

1.B族鏈球菌16S?rRNA的RT-PCR檢測引物，其特征在于，包括用于擴增檢測GBS16srRNA的上下游引物對GBS-16s-F和GBS-16s-R，內參引物對interior-F和interior-R，所述GBS-16s-F、GBS-16s-R、interior-F、interior-R的核苷酸序列分別依次如SEQ?ID?NO:1～SEQ?ID?NO:4所示。

2.如權利要求1所述的B族鏈球菌16S?rRNA的RT-PCR檢測引物對應的探針，其特征在于，包括GBS?16s?rRNA檢測探針GBS-16s-P和內參探針interior-P，所述GBS-16s-P如SEQID?NO:5所示，所述interior-P如SEQ?ID?NO:6所示。

3.如權利要求2所述的B族鏈球菌16S?rRNA的RT-PCR檢測引物對應的探針，其特征在于，所述GBS-16s-P和interior-P的核苷酸序列5’端均標記熒光報告基團，3’端均標記熒光淬滅基團MGB；其中，所述熒光報告基團選自FAM、HEX、VIC、ROX、TET、JOE或CY3中的任意一種，且GBS-16s-P和interior-P的核苷酸序列5’端熒光報告基團不同。

4.如權利要求3所述的B族鏈球菌16S?rRNA的RT-PCR檢測引物對應的探針，其特征在于，所述GBS-16s-P的核苷酸序列5’端標記HEX熒光報告基團；所述interior-P的核苷酸序列5’端標記FAM熒光報告基團。

5.一種用于B族鏈球菌16S?rRNA的RT-PCR的檢測試劑盒，其特征在于，包括權利要求1所述的引物和權利要求2～4任意一項所述的探針。

6.如權利要求5所述的用于B族鏈球菌16S?rRNA的RT-PCR的檢測試劑盒，其特征在于，引物對GBS-16s-F和GBS-16s-R和檢測探針GBS-16s-P的摩爾度比為1：1：0.2～1；引物對interior-F和interior-R和內參探針interior-P的摩爾濃度比為1：1：0.2～1。

7.如權利要求5所述的用于B族鏈球菌16S?rRNA的RT-PCR的檢測試劑盒，其特征在于，還包括PCR反應液、陽性對照液和陰性對照液；所述陽性對照液為含有目標片段的質粒溶液；所述陰性對照液為不含有B族鏈球菌的溶液、無RNA酶水或生理鹽水；所述PCR反應液的成分組成為：RT-PCR熒光探針法預混體系8～12μL；GBS?16s?rRNA擴增的引物對和GBS?16srRNA檢測探針的摩爾比例為：GBS-16s-F：GBS-16s-R：GBS-16s-P＝1：1：0.2～1；所述內標擴增的引物對和標檢測的探針的摩爾比例為：Interior-F：Interior-R：Interior-P＝1：1：0.2～1；加無RNA酶水至20μL。

8.如權利要求7所述的用于B族鏈球菌16S?rRNA的RT-PCR的檢測試劑盒，其特征在于，所述PCR反應液的反應條件為：

逆轉錄：55℃10分鐘；

變性：95℃1分鐘；

退火，延伸及熒光采集：60℃30秒，45個循環。

9.如權利要求5所述的用于B族鏈球菌16S?rRNA的RT-PCR的檢測試劑盒，其特征在于，使用方法包括以下步驟：

S1.提取樣品RNA；

S2.加樣：將樣品RNA、陰性對照液、陽性對照液分別對應加入裝有PCR反應液的PCR反應管/板中，總體積分別為20μL，得對應的樣品PCR反應體系、陰性PCR反應體系和陽性PCR反應體系；

S3.PCR擴增：將S2所得樣品PCR反應體系、陰性PCR反應體系和陽性PCR反應體系分別置于熒光定量PCR儀上，設置反應程序，進行PCR擴增；其中熒光檢測通道選擇為：選擇HEX通道檢測B族鏈球菌，選擇FAM通道檢測內標；

S4.PCR擴增反應結束后，根據熒光曲線判斷是否感染B族鏈球菌。

10.如權利要求5所述的用于B族鏈球菌16S?rRNA的RT-PCR的檢測試劑盒在檢測復雜樣品中的應用，其特征在于，所述復雜樣品為含有全血、糞便、尿液、白帶、粘蛋白、人類基因組DNA、米康唑栓劑、克霉唑栓劑、制霉菌素軟膏、易蒙停中的一種或幾種雜質的樣品。