[發(fā)明專利]尖吻蝮蛇磷脂酶A2特征多肽組及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202310433239.7
• 申請日: 2023-04-21
• 公開（公告）號: CN116217666A
• 公開（公告）日: 2023-06-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 咸瑞卿;薛維麗;王聰聰;王夙博;王維劍;張冬梅;賀美蓮;石峰
• 申請（專利權(quán)）人: 山東省食品藥品檢驗研究院
• 主分類號: C07K7/06
• 分類號: C07K7/06;C07K7/08;G01N33/68;G01N30/02;G01N30/06;G01N30/72
• 代理公司: 北京元本知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11308
• 代理人: 徐蘋

本發(fā)明涉及化學(xué)分析定性檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一組尖吻蝮蛇磷脂酶A2特征多肽及其應(yīng)用。所述特征多肽組由特征多肽1和特征多肽2組成，具體的氨基酸序列為：特征多肽1氨基酸序列為WDIYPYSWK，特征多肽2氨基酸序列為DNLDTYNSDTYWR。該特征多肽組可用于檢測待測樣品中尖吻蝮蛇磷脂酶A2特征多肽種屬來源，檢測準(zhǔn)確度高，可以顯著提高尖吻蝮蛇血凝酶的質(zhì)量控制水平，確保產(chǎn)品臨床用藥的有效性和安全性。另一方面也為尖吻蝮蛇磷脂酶A2更多藥理學(xué)活性和臨床應(yīng)用的開發(fā)提供了保障。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及化學(xué)分析定性檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及尖吻蝮蛇磷脂酶A2特征多肽組及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

蛇毒磷脂酶A2（phospholipase?A2，PLA2）是蛇毒腺中含量最豐富的酶之一，根據(jù)“?靶位點與作用位點”學(xué)說，不同種屬來源PLA2結(jié)構(gòu)不同，作用方式不同，表現(xiàn)出不一樣的藥理活性，如突觸前神經(jīng)毒素可能與PLA2上的80～110位殘基之間的疏水性區(qū)域有關(guān)；在肌肉毒素活性PLA2疏水的E螺旋中含有特異的氧離子區(qū)域；與抗凝活性有關(guān)的是54－77為殘基區(qū)域，有強抗凝活性的PLA2?的賴氨酸被中性氨基酸或者酸性氨基酸所代替，而在沒有抗凝活性的PLA2中則沒有這一現(xiàn)象。

研究表明尖吻蝮蛇磷脂酶A2抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集，催化水解sn-3-磷酸甘油酯2位上酯酰鍵生成游離的脂肪酸和溶血磷脂。尖吻蝮蛇血凝酶作為止血藥，廣泛應(yīng)用于臨床止血中。磷脂酶A2作為潛在的雜質(zhì)，具有引起神經(jīng)毒性、肌肉毒性、心毒性，還有一些引起驚厥、降血壓以及水腫等副作用，因此對血凝酶制劑中的磷脂酶控制十分重要。目前標(biāo)準(zhǔn)中磷脂酶A2采用紫外-可見分光光度法，操作復(fù)雜，靈敏度較低。因此無論是作為具有研究價值的新型抗炎藥物，還是作為尖吻蝮蛇血凝酶中的雜質(zhì)，開發(fā)一種簡便快捷、具有種屬鑒別作用的方法對尖吻蝮蛇磷脂酶A2研究及尖吻蝮蛇血凝酶藥物的質(zhì)量控制十分重要。

發(fā)明內(nèi)容

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的是提供尖吻蝮蛇磷脂酶A2特征多肽組，所述特征多肽組能夠在表征樣品中尖吻蝮蛇磷脂酶A2的種屬來源中發(fā)揮重要作用，填補了尖吻蝮蛇磷脂酶A2種屬鑒別的空白。

為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

尖吻蝮蛇磷脂酶A2特征多肽組，所述特征多肽組由特征多肽1和特征多肽2組成；其中特征多肽1的氨基酸序列為WDIYPYSWK，特征多肽2的氨基酸序列為DNLDTYNSDTYWR。

一種上述尖吻蝮蛇磷脂酶A2特征多肽組的應(yīng)用，所述特征多肽組可用于鑒別尖吻蝮蛇磷脂酶A2的種屬來源鑒別。

進一步地，上述應(yīng)用采用以下鑒別步驟：

（1）取待測樣品溶解，進行酶解滅活后作為供試品溶液；

（2）水經(jīng)過酶解處理，制備空白溶液；

（3）取步驟（1）所制備的供試品溶液及步驟（2）所制備的空白溶液注入液相色譜-質(zhì)譜儀，采用電噴霧正離子模式，進行多反應(yīng)監(jiān)測，以質(zhì)荷比m/z?629.30→302.11及629.30→680.34作為特征多肽1的檢測離子對，以質(zhì)荷比m/z?831.86→230.08及831.86→941.41作為特征多肽2的檢測離子對，以確定待測樣品中是否含有尖吻蝮蛇磷脂酶A2特征多肽中的特征多肽1和特征多肽2；

（4）如果同時檢測到特征多肽1和特征多肽2，則證明待測樣品中含有磷脂酶A2且來源于尖吻蝮蛇；反之若則證明待測樣品中不含有來自尖吻蝮蛇的磷脂酶A2。

優(yōu)選地，步驟（3）所述液相色譜-質(zhì)譜儀中液相和質(zhì)譜檢測條件中，液相條件為：Waters?ACQUITY?UPLC?BEH?C₁₈?色譜柱（50?mm*2.1?mm，1.7?μm）；流動相A：0.1%甲酸溶液流動相，B：0.1%甲酸乙腈；柱溫：40℃；進樣量：2?μL；流速：0.3?ml/min；按下表進行梯度洗脫：

優(yōu)選地，步驟（2）的具體操作為：