[發明專利]從肌肉中分離提取檢測AOC藥物小核酸的試劑盒及其方法

在審

• 申請號: 202310428945.2
• 申請日: 2023-04-20
• 公開（公告）號: CN116606906A
• 公開（公告）日: 2023-08-18
• 發明（設計）人: 盛飛
• 申請（專利權）人: 迦進生物醫藥（上海）有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/6876;C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 廣東普潤知識產權代理有限公司 44804
• 代理人: 寇闖

本發明適用于分子生物學技術領域，提供一種從肌肉中分離提取AOC藥物小核酸的試劑盒，包括裂解液Ⅰ、裂解液Ⅱ和工作液，所述裂解液Ⅰ包括0.05?0.09M磷酸鹽緩沖液、0.5?1.5M氯化鈉和0.1?0.4％TritonX?100，所述裂解液Ⅰ的pH為6.5，所述裂解液Ⅱ包括50?150μg/ml蛋白酶K、20?80mM?Tris?HCl和7?13nM氯化鈣，所述裂解液Ⅱ的pH為7.5，所述工作液包括200?300mM?Tris?HCl、350?400mM氯化鉀、10?20nM氯化鎂、0.05?0.15M?DTT、20?60u/μL?RNase抑制劑和0.5?5U逆轉錄酶，所述工作液的pH為8.3。本發明還提供一種使用該試劑盒分離提取并測量AOC藥物小核酸的方法。使用本發明的試劑盒分離的小核酸質量好、成本低而且操作簡單。提高了AOC藥物在肌肉中的分離效率，具有廣泛的應用場景和推廣價值。

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，具體涉及一種從肌肉中分離提取檢測AOC藥物小核酸的試劑盒及其方法。

背景技術

寡核苷酸(小核酸)藥物主要包括反義核酸(ASO)、小干擾RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、小激活RNA(saRNA)、信使RNA(mRNA)適配體(aptamer)、核酶(ribozyme)、抗體核酸偶聯藥物(ARC)等。小核酸藥物是與小分子藥物、抗體藥物完全不同的全新藥物類別，其藥物構成為核苷酸序列，藥物機制為通過和靶基因mRNA堿基互補配對引導沉默復合體(RISC)降解mRNA或抑制mRNA的翻譯，在轉錄后水平調控蛋白表達，從而實現治療疾病的目的。寡核苷酸藥物中的小核酸具有選擇性，但仍面臨血清不穩定、膜通透性低和缺乏組織選擇性等挑戰。而抗體具有更長的半衰期、在細胞內選擇性遞送藥物的能力以及其靶向特性，被證明是靶向遞送寡核苷酸的理想載體之一，抗體偶聯小核酸(AOC，Antibody?OligonucleotideConjugate)即將抗體作為靶向遞送寡核苷酸的載體，主要有三部分構成：發揮組織靶向作用的抗體、連接子(linker)和作為payload的小核酸。其中小核酸包括正義鏈和反義鏈，其中正義鏈通過共價鍵偶聯在抗體上，反義鏈通過堿基互補配對與正義鏈形成雙鏈。小核酸在人體內的組織分布決定著AOC藥物的藥效，然而傳統的小核酸提取試劑盒通過蛋白變性、離心等方法去除蛋白質等雜質，然后分離得到小核酸，而由于AOC藥物是抗體通過共價鍵偶聯小核酸藥物，因此使用傳統的方法會將抗體上偶聯的小核酸去除，難以將AOC藥物上的小核酸分離提取出來，因此目前市場上缺少高效的試劑盒或方法檢測AOC藥物小核酸的組織分布。

發明內容

為了解決上述問題，本發明提供了一種從肌肉中分離提取檢測AOC藥物小核酸的試劑盒及其方法。

為實現本發明目的，本發明提供一種從肌肉中分離提取AOC藥物小核酸的試劑盒，包括裂解液Ⅰ、裂解液Ⅱ和工作液，所述裂解液Ⅰ包括0.05-0.09M磷酸鹽緩沖液、0.5-1.5M氯化鈉和0.1-0.4％?TritonX-100，所述裂解液Ⅰ的pH為6.0-7.0，所述裂解液Ⅱ包括50-150μg/ml蛋白酶K、20-80mM?Tris-HCl和7-13nM氯化鈣，所述裂解液Ⅱ的pH為7.0-8.0，所述工作液包括200-300mM?Tris-HCl、350-400mM氯化鉀、10-20nM氯化鎂、0.05-0.15M?DTT、20-60u/μL?RNase抑制劑和0.5-5U逆轉錄酶，所述工作液的pH為8.0-8.6。

進一步的，所述裂解液Ⅰ由0.07M磷酸鹽緩沖液、1M氯化鈉和0.25％TritonX-100組成，所述裂解液Ⅰ的pH為6.5。

進一步的，所述裂解液Ⅱ由125μg/ml蛋白酶K、50mM?Tris-HCl和10nM氯化鈣組成，所述裂解液Ⅱ的pH為7.5。

進一步的，所述工作液由250mM?Tris-HCl、375mM氯化鉀、15nM氯化鎂、0.1M?DTT、40u/μL?RNase抑制劑和1U逆轉錄酶組成，所述工作液的pH為8.3。