[發明專利]從肌肉中分離提取檢測AOC藥物小核酸的試劑盒及其方法

在審

• 申請號: 202310428945.2
• 申請日: 2023-04-20
• 公開（公告）號: CN116606906A
• 公開（公告）日: 2023-08-18
• 發明（設計）人: 盛飛
• 申請（專利權）人: 迦進生物醫藥（上海）有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/6876;C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 廣東普潤知識產權代理有限公司 44804
• 代理人: 寇闖

1.一種從肌肉中分離提取AOC藥物小核酸的試劑盒，其特征在于，包括裂解液Ⅰ、裂解液Ⅱ和工作液，所述裂解液Ⅰ包括0.05-0.09M磷酸鹽緩沖液、0.5-1.5M氯化鈉和0.1-0.4％TritonX-100，所述裂解液Ⅰ的pH為6.0-7.0，所述裂解液Ⅱ包括50-150μg/ml蛋白酶K、20-80mM?Tris-HCl和7-13nM氯化鈣，所述裂解液Ⅱ的pH為7.0-8.0，所述工作液包括200-300mMTris-HCl、350-400mM氯化鉀、10-20nM氯化鎂、0.05-0.15M?DTT、20-60u/μL?RNase抑制劑和0.5-5U逆轉錄酶，所述工作液的pH為8.0-8.6。

2.如權利要求1所述的從肌肉中分離提取AOC藥物小核酸的試劑盒，其特征在于，所述裂解液Ⅰ由0.07M磷酸鹽緩沖液、1M氯化鈉和0.25％TritonX-100組成，所述裂解液Ⅰ的pH為6.5。

3.如權利要求1所述的從肌肉中分離提取AOC藥物小核酸的試劑盒，其特征在于，所述裂解液Ⅱ由125μg/ml蛋白酶K、50mM?Tris-HCl和10nM氯化鈣組成，所述裂解液Ⅱ的pH為7.5。

4.如權利要求1所述的從肌肉中分離提取AOC藥物小核酸的試劑盒，其特征在于，所述工作液由250mM?Tris-HCl、375mM氯化鉀、15nM氯化鎂、0.1M?DTT、40u/μL?RNase抑制劑和1U逆轉錄酶組成，所述工作液的pH為8.3。

5.一種使用如權利要求1-4任一項所述的試劑盒從肌肉中分離提取檢測AOC藥物小核酸的方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1.取肌肉組織，按照1：4的比例加入所述裂解液Ⅰ，冰上剪碎組織并破碎細胞；

S2.加入所述裂解液Ⅱ，混勻后55℃孵育30分鐘，然后95℃變性10分鐘，隨后冰上迅速冷卻；

S3.4℃4000g離心20分鐘，取上清稀釋10倍；

S4.將上清加入到逆轉錄反應體系中進行逆轉錄，之后以逆轉錄得到的核酸片段為模板進行qPCR反應，得到CT值結果；

S5.使用PBS稀釋AOC藥物，從最高濃度點4倍梯度稀釋，10個濃度點，之后將各濃度點的稀釋液按S1-S4的步驟操作，得到各濃度點的稀釋液的CT值結果，根據各濃度點和對應的CT值結果繪制標準曲線；

S6.將S4得到的CT值代入S5制備的標準曲線中，得到AOC藥物小核酸的濃度。

6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述逆轉錄反應體系包括10μL工作液、50nMantisense?stem-loop莖環逆轉錄引物，最后ddH₂O補足到10μL；所述逆轉錄的反應條件為16℃30min，42℃30min，85℃5min；所述逆轉錄采用的antisense?stem-loop莖環逆轉錄引物的序列組成為GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACATTCCTA。

7.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述S5和S6中qPCR反應體系為：5μL?1xTaqMan?Universal?PCR?Master?Mix、0.2mM?antisense?Probe、1.5mM?antisense?F、0.7mMreverse和1μL模板，最后ddH₂O補足到10μL；qPCR反應的程序為：95℃處理10分鐘后進入循環：95℃處理15秒，60℃處理1分鐘，共40個循環；所述qPCR采用的antisense?F的序列組成為GCGCATAAAATCTACAGTCA，reverse的序列組成為GTGCAGGGTCCGAGGT，antisense?Probe的序列組成為FAM-CGCACTGGATACGACATTCC-MGB。

8.如權利要求1-4任一項所述的試劑盒在分離提取檢測肌肉中的AOC藥物小核酸的用途。

9.如權利要求8所述的用途，其特征在于，使用qPCR技術檢測AOC藥物小核酸的濃度以評估AOC藥物的藥效，所述肌肉為腓腸肌和/或股四頭肌。