[發明專利]一種提高土霉素菌株正向突變率的方法

在審

• 申請號: 202310425115.4
• 申請日: 2023-04-20
• 公開（公告）號: CN116496943A
• 公開（公告）日: 2023-07-28
• 發明（設計）人: 王雪峰;鄭輝;張麗媛;王曉朦;劉東岳
• 申請（專利權）人: 石家莊職業技術學院（石家莊開放大學）
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N15/01;C12R1/59;C12R1/19
• 代理公司: 北京慧希專利代理事務所(普通合伙) 16062
• 代理人: 劉玲玲

本發明公開了一種提高土霉素菌株正向突變率的方法，屬于微生物育種技術領域。本發明通過將土霉素菌株龜裂鏈霉菌和大腸桿菌混合培養，由于生存資源有限，菌體之間會展開殘酷的競爭，所以土霉素菌株龜裂鏈霉菌會產出更多可以殺死大腸桿菌的化學物質（土霉素），從而使得正向突變率得到了十分顯著的提高；另外，本發明的方法操作簡單，容易實施，可以降低篩選的工作量，縮短篩選的周期，這十分有利于工廠進行大規模的篩選，獲得較多的土霉素高產菌株，進而降低生產成本。

技術領域

本發明涉及一種提高菌株突變率的方法，具體涉及一種提高土霉素菌株正向突變率的方法，屬于微生物育種技術領域。

背景技術

土霉素（Oxytetracycline，OTC）又稱氧四環素，屬于四環素類廣譜抗生素，主要抗菌機制是特異性地與細菌核糖體30S亞基A位結合，阻止氨酰tRNA核糖體復合體的形成，抑制蛋白質多肽鏈的延長，對革蘭氏陽性菌、陰性菌、支原體、衣原體、立克次氏體等引起的感染均有很好療效，在畜牧業、水產養殖業以及其它領域具有廣泛的應用。

近年來，基因工程定向改造龜裂鏈霉菌（Streptomyces?rimosus）提高土霉素產量方面的文章報道得越來越多，但傳統的微生物誘變育種仍然是不可或缺的一種手段。然而，采用傳統的微生物誘變育種方法篩選菌株時，不僅篩選工作量大、篩選周期長，而且正向突變率較低（20%左右）。因此，有必要開發新的篩選方法，以降低篩選工作量、縮短篩選周期、提高篩選的正向突變率。

發明內容

為解決現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種可以降低篩選的工作量、縮短篩選的周期、顯著提高土霉素菌株正向突變率的方法。

為了實現上述目標，本發明采用如下的技術方案：

一種提高土霉素菌株正向突變率的方法，包括以下步驟：

Step1：將土霉素菌株龜裂鏈霉菌于斜面培養基上培養至成熟，然后將孢子制成孢子懸液，并對孢子懸液進行UV誘變或ARTP誘變；

Step2：向誘變結束后的孢子懸液中加入大腸桿菌，大腸桿菌與孢子的數量比為0.5-1.5：1，混合均勻后稀釋并涂布于平板培養基上，于37℃正置培養12h，之后再向平板培養基上涂布萘啶酮酸，萘啶酮酸的終濃度為20-50μg/mL，繼續培養5d；

Step3：培養結束后，收集孢子并制成孢子懸液，將孢子懸液涂布于平板培養基上，于37℃培養5d；

Step4：培養結束后，從平板培養基上挑選出成熟的單菌落，或者將平板放于4℃冰箱中保存2d并從平板培養基上挑選出水解圈較大的單菌落，將挑選出來的單菌落分別接種到斜面培養基上培養至成熟，然后將孢子刮下并分別接種至種子培養基中培養至成熟，之后按照5%的接種量分別接種到發酵培養基中培養至發酵結束。

優選的，在Step1和Step4中，以質量百分比計，所述斜面培養基的組成為：麩皮7.0%，瓊脂2.2%，自來水配制，pH自然。

優選的，在Step2中和Step3，以質量百分比計，所述平板培養基的組成為：淀粉3.0%，碳酸鈣0.3%，硫酸銨0.4%，氯化鈉0.5%，玉米漿1.0%，瓊脂2.2%，自來水配制，pH自然。

優選的，在Step4中，以質量百分比計，所述種子培養基的組成為：淀粉3.0%，黃豆餅粉0.3%，碳酸鈣0.5%，硫酸銨0.4%，氯化鈉0.5%，磷酸二氫鉀0.015%，玉米漿1.0%，自來水配制，pH自然；所述發酵培養基的組成為：淀粉12.0%，黃豆餅粉2.0%，碳酸鈣1.5%，硫酸銨1.5%，氯化鈉0.4%，磷酸二氫鉀0.01%，氯化鈷0.001%，玉米漿1.0%，消沫劑0.01%，淀粉酶0.012%，自來水配制，pH自然。

另外一種提高土霉素菌株正向突變率的方法，包括以下步驟：

Step1：將土霉素菌株龜裂鏈霉菌于斜面培養基上培養至成熟，然后將孢子制成孢子懸液，并對孢子懸液進行UV誘變或ARTP誘變；