[發明專利]一種提高土霉素菌株正向突變率的方法

在審

• 申請號: 202310425115.4
• 申請日: 2023-04-20
• 公開（公告）號: CN116496943A
• 公開（公告）日: 2023-07-28
• 發明（設計）人: 王雪峰;鄭輝;張麗媛;王曉朦;劉東岳
• 申請（專利權）人: 石家莊職業技術學院（石家莊開放大學）
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N15/01;C12R1/59;C12R1/19
• 代理公司: 北京慧希專利代理事務所(普通合伙) 16062
• 代理人: 劉玲玲

1.一種提高土霉素菌株正向突變率的方法，其特征在于，包括以下步驟：

Step1：將土霉素菌株龜裂鏈霉菌于斜面培養基上培養至成熟，然后將孢子制成孢子懸液，并對孢子懸液進行UV誘變或ARTP誘變；

Step2：向誘變結束后的孢子懸液中加入大腸桿菌，大腸桿菌與孢子的數量比為0.5-1.5：1，混合均勻后稀釋并涂布于平板培養基上，于37℃正置培養12h，之后再向平板培養基上涂布萘啶酮酸，萘啶酮酸的終濃度為20-50μg/mL，繼續培養5d；

Step3：培養結束后，收集孢子并制成孢子懸液，將孢子懸液涂布于平板培養基上，于37℃培養5d；

Step4：培養結束后，從平板培養基上挑選出成熟的單菌落，或者將平板放于4℃冰箱中保存2d并從平板培養基上挑選出水解圈較大的單菌落，將挑選出來的單菌落分別接種到斜面培養基上培養至成熟，然后將孢子刮下并分別接種至種子培養基中培養至成熟，之后按照5%的接種量分別接種到發酵培養基中培養至發酵結束。

2.根據權利要求1所述的提高土霉素菌株正向突變率的方法，其特征在于，在Step1和Step4中，以質量百分比計，所述斜面培養基的組成為：麩皮7.0%，瓊脂2.2%，自來水配制，pH自然。

3.根據權利要求1所述的提高土霉素菌株正向突變率的方法，其特征在于，在Step2中和Step3，以質量百分比計，所述平板培養基的組成為：淀粉3.0%，碳酸鈣0.3%，硫酸銨0.4%，氯化鈉0.5%，玉米漿1.0%，瓊脂2.2%，自來水配制，pH自然。

4.根據權利要求1所述的提高土霉素菌株正向突變率的方法，其特征在于，在Step4中，以質量百分比計，所述種子培養基的組成為：淀粉3.0%，黃豆餅粉0.3%，碳酸鈣0.5%，硫酸銨0.4%，氯化鈉0.5%，磷酸二氫鉀0.015%，玉米漿1.0%，自來水配制，pH自然；所述發酵培養基的組成為：淀粉12.0%，黃豆餅粉2.0%，碳酸鈣1.5%，硫酸銨1.5%，氯化鈉0.4%，磷酸二氫鉀0.01%，氯化鈷0.001%，玉米漿1.0%，消沫劑0.01%，淀粉酶0.012%，自來水配制，pH自然。

5.一種提高土霉素菌株正向突變率的方法，其特征在于，包括以下步驟：

Step1：將土霉素菌株龜裂鏈霉菌于斜面培養基上培養至成熟，然后將孢子制成孢子懸液，并對孢子懸液進行UV誘變或ARTP誘變；

Step2：將誘變結束后的孢子懸液接種至菌絲培養基中，在30℃、220rpm的條件下震蕩培養4h，然后再接入大腸桿菌，大腸桿菌與菌絲培養初始時刻的孢子的數量比為0.5-1.5：1，在30℃、220rpm的條件下繼續震蕩培養6h，然后將混合培養液稀釋并涂布于含有萘啶酮酸的平板培養基上，于37℃培養5d；

Step3：培養結束后，從平板培養基上挑選出成熟的單菌落，分別接種到斜面培養基上培養至成熟，然后將孢子刮下并分別接種至種子培養基中培養至成熟，之后按照5%的接種量分別接種到發酵培養基中培養至發酵結束。

6.根據權利要求5所述的提高土霉素菌株正向突變率的方法，其特征在于，在Step1和Step3中，以質量百分比計，所述斜面培養基的組成為：麩皮7.0%，瓊脂2.2%，自來水配制，pH自然。

7.根據權利要求5所述的提高土霉素菌株正向突變率的方法，其特征在于，在Step2中，以質量百分比計，所述菌絲培養基的組成為：葡萄糖1.0%，蛋白胨0.4%，酵母粉0.4%，硫酸鎂0.05%，磷酸二氫鉀0.2%，磷酸氫二鉀0.4%，自來水配制，pH自然。

8.根據權利要求5所述的提高土霉素菌株正向突變率的方法，其特征在于，在Step2中，以質量百分比計，所述含有萘啶酮酸的平板培養基的組成為：淀粉3.0%，碳酸鈣0.3%，硫酸銨0.4%，氯化鈉0.5%，玉米漿1.0%，瓊脂2.2%，萘啶酮酸終濃度20-50μg/mL，自來水配制，pH自然。

9.根據權利要求5所述的提高土霉素菌株正向突變率的方法，其特征在于，在Step3中，以質量百分比計，所述種子培養基的組成為：淀粉3.0%，黃豆餅粉0.3%，碳酸鈣0.5%，硫酸銨0.4%，氯化鈉0.5%，磷酸二氫鉀0.015%，玉米漿1.0%，自來水配制，pH自然；所述發酵培養基的組成為：淀粉12.0%，黃豆餅粉2.0%，碳酸鈣1.5%，硫酸銨1.5%，氯化鈉0.4%，磷酸二氫鉀0.01%，氯化鈷0.001%，玉米漿1.0%，消沫劑0.01%，淀粉酶0.012%，自來水配制，pH自然。