[發明專利]一種用于篩選高親和力納米抗體的工程菌及其應用

在審

• 申請號: 202310413773.1
• 申請日: 2023-04-18
• 公開（公告）號: CN116606790A
• 公開（公告）日: 2023-08-18
• 發明（設計）人: 王文義;胡悅;霍莉;黃文娣;蔣詩越;楊佳敏
• 申請（專利權）人: 中南民族大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12N15/11;C12N15/13;C12N15/65;C12N15/66;C07K16/00;C40B30/04;C12R1/19
• 代理公司: 北京輕創知識產權代理有限公司 11212
• 代理人: 賴定珍

本發明涉及納米抗體篩選技術，具體而言，涉及一種用于篩選高親和力納米抗體的工程菌及其應用。該工程菌為含有雙表達載體的大腸桿菌；雙表達載體中含有目的抗原蛋白序列、抗原蛋白的納米抗體序列、氨芐青霉素抗性基因TEM?1型β?內酰胺酶的兩個片段BLF1和BLF2的序列。該篩選方法將工程菌待測菌液在含有氨芐青霉素的培養基上培養至生長菌落，并根據菌落生長情況篩選親和力高的納米抗體。該方法操作簡單、易于推廣、培養成本低、效率高，且具有良好的可靠性。

技術領域

本發明涉及納米抗體篩選技術，具體而言，涉及一種用于篩選高親和力納米抗體的工程菌及其應用。

背景技術

抗體具有高度特異性的抗原結合能力，可用于檢測和操縱目的蛋白，因此在基礎研究以及靶向藥物治療中發揮著重要作用。納米抗體(Nbs)，也稱為VHHs或單域抗體(sdAbs)，源于駱駝單鏈抗體(HCAbs)的可變域。納米抗體的體積僅為傳統抗體的十分之一，但仍然保留了高親和力和特異性。此外，納米抗體表現出高溫耐受(60-80℃)、抗蛋白酶酶解等特點，而且在組織穿透能力、隱蔽表位可及性和蛋白穩定性方面優于傳統抗體。因此，納米抗體在不同領域獲得廣泛應用。

抗體的抗原結合能力對于抗體的功能發揮極為重要，然而，通過噬菌體文庫篩選等方法直接得到的原始納米抗體，特別是通過天然文庫或人工合成文庫篩選得到的納米抗體的抗原親和力往往難以滿足需要。高親和力納米抗體多通過嚴格的篩選方法或在篩選出的原始納米抗體的基礎上進一步優化獲得。對關鍵結合位點的飽和突變結合展示篩選技術是常用的優化方法，但該方法基于蛋白質結構信息，極大地限制了其使用范圍。

發明內容

本發明的目的在于：提供一種用于篩選高親和力納米抗體的工程菌及其應用。

為實現本發明的目的，提供技術方案如下：

本發明提供一種用于篩選高親和力納米抗體的工程菌，所述工程菌為含有雙表達載體的大腸桿菌；所述雙表達載體中含有目的抗原蛋白的序列、納米抗體的序列、以及氨芐青霉素抗性基因TEM-1型β-內酰胺酶的兩個片段BLF1和BLF2的序列。

進一步，所述大腸桿菌的菌株為Origami(DE3)。

進一步，所述雙表達載體為pRSFDuet-1-BLF1-Linker-POI-Nb-Linker-BLF2；其中，所述pRSFDuet-1為載體質粒，所述POI為目的抗原蛋白的序列，所述Nb為納米抗體的序列。

本發明還提供一種如上述的用于篩選高親和力納米抗體的工程菌的構建方法，包括以下步驟：

S1、合成C端含有Linker的片段BLF1-Linker，所述BLF1-Linker片段的序列如SEQID?NO:1所示；再將所述BLF1-Linker片段、所述目的抗原蛋白的DNA片段與pRSFDuet-1進行連接，測序正確后，得到載體pRSFDuet-1-BLF1-Linker-POI；

S2、合成N端含有Linker的片段Linker-BLF2，所述Linker-BLF2片段的序列如SEQID?NO:3所示；將所述納米抗體的DNA片段、所述Linker-BLF2片段與載體pRSFDuet-1-BLF1-Linker連接，測序正確后，得到所述雙表達載體pRSFDuet-1-BLF1-Linker-POI-Nb-Linker-BLF2；

S3、將所述雙表達載體pRSFDuet-1-BLF1-Linker-POI-Nb-Linker-BLF2轉入所述Origami(DE3)中。

進一步，所述BLF1-Linker片段的5’端和3’端分別帶有BamHI和PstI酶切位點，所述BLF1-Linker片段編碼的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:2所示；