[發明專利]一種冬油菜越冬記憶候選基因的鑒定方法及應用

在審

• 申請號: 202310401143.2
• 申請日: 2023-04-15
• 公開（公告）號: CN116574786A
• 公開（公告）日: 2023-08-11
• 發明（設計）人: 劉麗君;許軍;方彥;楊剛;馬驪;武軍艷;孫萬倉;蒲媛媛;王旺田;李學才
• 申請（專利權）人: 甘肅農業大學
• 主分類號: C12Q1/6809
• 分類號: C12Q1/6809;C12Q1/6895
• 代理公司: 北京慕達星云知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 魏志恒

本發明公開了一種冬油菜越冬記憶候選基因的鑒定方法，涉及冬油菜越冬記憶機制解析技術領域，本發明對白菜型冬油菜冬前期、越冬期、返青期的根頸部進行取樣，通過轉錄組調查基因的表達模式，對差異基因表達趨勢進行分析，從而發現潛在的冬油菜越冬記憶候選基因。本發明方法是在冬油菜不同生長發育時期，采集自然降溫狀態下冬油菜根頸部組織；采用轉錄組學獲得冬油菜根頸部基因定量表達結果，對冬油菜根頸部不同時期的差異表達基因進行鑒定后分析其表達趨勢，獲得的“+,+”、“?,?”、“?,+”、“+,?”4種顯著富集趨勢可認定為越冬記憶候選基因，可用于冬油菜越冬能力提高、抗寒品種(系)選育、抗寒性改良等方面。

技術領域

本發明涉及冬油菜越冬記憶機制解析技術領域，更具體的說是涉及一種冬油菜越冬記憶候選基因的鑒定方法及應用。

背景技術

冬油菜作為北方地區良好的冬春季覆蓋作物和唯一的越冬油料作物，其種植除可增加油料作物播種面積和冬春季土表覆蓋度外，秸稈還田還可以有效增加土壤有機質含量，提高復種指數和下茬作物產量。同時冬油菜種植避免了與其他油料作物競爭土地，因此在我國北方地區開展冬油菜種植，除可提高菜籽油的供給以緩解食用油短缺的問題外，亦可減輕土壤風蝕，增加農民收入，改善生態環境。

冬油菜秋季播種，越冬期長達半年，因此冬油菜生產的首要考慮是保證安全越冬。根作為北方冬油菜越冬期間唯一存活的器官，是決定冬油菜能否越冬的關鍵器官，越冬期間營養物質主要儲存在根頸部。

目前，北方寒區針對冬油菜遺傳改良的主要研究方向是抗寒性方面的研究。主要集中在低溫脅迫的生理生化響應方面，對冬油菜是如何感知越冬期的來臨，如何“記住”越冬期以通過春化調節生長發育與開花期之間的平衡等機制研究較少，限制了提升冬油菜越冬能力以及抗寒系品種的選育等研究效率。

因此，如何篩選獲得冬油菜越冬基因是本領域技術人員亟需解決的問題。

發明內容

有鑒于此，本發明提供了一種冬油菜越冬記憶候選基因的鑒定方法。

為了實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種冬油菜越冬記憶候選基因的鑒定方法，對白菜型冬油菜冬前期、越冬期、返青期的根頸部進行取樣，通過轉錄組調查基因的表達模式，對差異基因表達趨勢進行分析，從而發現潛在的冬油菜越冬記憶候選基因；具體包括以下步驟：

(1)取樣：自冬油菜田間生長至六葉期開始采樣，采樣間隔時間20-22d；

(2)提取冬油菜根頸部RNA，構建cDNA文庫；

(3)采用Illumina測序平臺對cDNA文庫進行測序；

(4)篩選組間差異表達基因；

(5)對差異基因表達趨勢進行分析，確定冬油菜根頸部中潛在的越冬記憶候選基因，進行功能富集分析。

作為優選的技術方案，步驟(1)所述取樣在10:30-11:30之間完成，六葉期為冬前期，定義為S1，之后每隔20-22d取樣一次，為越冬期，定義為S2-S5，返青后取樣為返青期，定義為S6；

每個時期至少采集3株根系洗去表面泥土，去離子水沖洗后紗布吸干水分，取根頸部組織切碎后混合取樣，每個時期采集3個生物學重復，液氮速凍后保存于-80℃備用。

作為優選的技術方案，步驟(2)所述提取冬油菜根頸部RNA的方法為：取100mg根頸部組織，利用植物總RNA提取試劑盒(DP432)按照說明書步驟進行提取；接著用無RNA酶的DNA酶對每個樣本所提RNA中的基因組DNA進行消化，最后用NanoDrop?2000分光光度計鑒定RNA的純度和濃度，并用Agilent?2100Bioanalyzer評估RNA完整性。