[發明專利]一種冬油菜越冬記憶候選基因的鑒定方法及應用

在審

• 申請號: 202310401143.2
• 申請日: 2023-04-15
• 公開（公告）號: CN116574786A
• 公開（公告）日: 2023-08-11
• 發明（設計）人: 劉麗君;許軍;方彥;楊剛;馬驪;武軍艷;孫萬倉;蒲媛媛;王旺田;李學才
• 申請（專利權）人: 甘肅農業大學
• 主分類號: C12Q1/6809
• 分類號: C12Q1/6809;C12Q1/6895
• 代理公司: 北京慕達星云知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 魏志恒

1.一種冬油菜越冬記憶候選基因的鑒定方法，其特征在于，對白菜型冬油菜冬前期、越冬期、返青期的根頸部進行取樣，通過轉錄組調查基因的表達模式，對差異基因表達趨勢進行分析，從而發現潛在的冬油菜越冬記憶候選基因；具體包括以下步驟：

(1)取樣：自冬油菜田間生長至六葉期開始采樣，采樣間隔時間20-22d；

(2)提取冬油菜根頸部RNA，構建cDNA文庫；

(3)采用Illumina測序平臺對cDNA文庫進行測序；

(4)篩選組間差異表達基因；

(5)對差異基因表達趨勢進行分析，確定冬油菜根頸部中潛在的越冬記憶候選基因，進行功能富集分析。

2.根據權利要求1所述的鑒定方法，其特征在于，步驟(1)所述取樣在10:30-11:30之間完成，六葉期為冬前期，定義為S1，之后每隔20-22d取樣一次，為越冬期，定義為S2-S5，返青后取樣為返青期，定義為S6；

每個時期至少采集3株根系洗去表面泥土，去離子水沖洗后紗布吸干水分，取根頸部組織切碎后混合取樣，每個時期采集3個生物學重復，液氮速凍后保存于-80℃備用。

3.根據權利要求1所述的鑒定方法，其特征在于，步驟(2)所述提取冬油菜根頸部RNA的方法為：取100mg根頸部組織，利用植物總RNA提取試劑盒按照說明書步驟進行提?。唤又脽oRNA酶的DNA酶對每個樣本所提RNA中的基因組DNA進行消化，最后鑒定RNA的純度和濃度，并評估RNA完整性。

4.根據權利要求1所述的鑒定方法，其特征在于，步驟(2)所述構建cDNA文庫的方法為：對質檢合格的RNA用帶有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA；加入打斷試劑將mRNA打斷成短片段，以打斷后的mRNA為模板，用六堿基隨機引物合成一鏈cDNA，然后配制二鏈合成反應體系合成二鏈cDNA，并使用試劑盒純化雙鏈cDNA；純化的雙鏈cDNA再進行末端修復、加A尾并連接測序接頭，然后進行片段大小選擇，最后進行PCR擴增。

5.根據權利要求1所述的鑒定方法，其特征在于，步驟(3)采用Illumina測序平臺對cDNA文庫進行測序的方法為：用Agilent?2100?Bioanalyzer對構建好的文庫進行質檢，合格后使用Illumina?HiSeqX?Ten測序儀進行測序，產生125bp或150bp的雙端數據。

6.根據權利要求1所述的鑒定方法，其特征在于，步驟(4)所述篩選組間差異表達基因的方法為：通過htseqcount軟件獲取落到各樣本中基因的reads數，接著使用DESeq(2012)Rpackage的estimate?Size?Factors函數對數據進行標準化處理后，利用nbinomTest函數計算差異比較的p-value和fold-change(FC)值；

將p-value值0.05和FC值2作為差異基因篩選的標準。

7.根據權利要求1所述的鑒定方法，其特征在于，步驟(5)所述對差異基因表達趨勢進行分析的方法為利用STEM軟件分析對差異基因表達趨勢進行分析，將其中持續上調的富集趨勢模式(Profile39)定義為“+,+”候選記憶基因，持續下調的富集趨勢模式(Profile8)定義為“-,-”候選記憶基因，先下調后上調的富集趨勢模式(Profile9)定義為“-,+”候選記憶基因，先上調后下調的富集趨勢模式(Profile48)定義為“+,-”候選記憶基因。

8.根據權利要求1所述的鑒定方法，其特征在于，所述鑒定方法還包括步驟(6)利用qPCR驗證候選基因表達模式，具體方法為：取2ug總RNA反轉錄為cDNA后進行qPCR分析，所選熒光試劑為Premix?Ex?Taq^TMII(TliRNaseH?Plus,TaKaRa)，擴增用熒光定量PCR儀為QuantStudio?5real-time?PCR?syste(ABI)，選候選基因進行qPCR分析，采用2^-△△Ct方法對基因相對表達量進行計算，所用參考基因為Actin。