[發明專利]一種靶向假體周圍巨噬細胞的CAR-MΦ體內外編輯制備方法及其應用

在審

• 申請號: 202310372687.0
• 申請日: 2023-04-10
• 公開（公告）號: CN116496413A
• 公開（公告）日: 2023-07-28
• 發明（設計）人: 姜新義;張盛昌;李子陽;付志鵬
• 申請（專利權）人: 山東大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;A61K39/00;A61K39/385;A61K9/107;A61P31/04;C12N5/10;C12N15/85
• 代理公司: 濟南金迪知識產權代理有限公司 37219
• 代理人: 孫振家

本發明涉及一種靶向假體周圍巨噬細胞的CAR?MΦ體內外編輯制備方法以及其應用。本發明設計并構建了一種針對金黃色葡萄球菌的嵌合抗原受體(SasA?CAR)，利用多肽納米膠束靶向局部微環境中的巨噬細胞，實現在體內外對巨噬細胞的基因編輯，從而使得CAR?巨噬細胞對金黃色葡萄球菌進行特異性識別、吞噬和清除，達到高效治療假體周圍多要耐藥菌感染的目的。

技術領域

本發明屬于骨科免疫治療技術領域，具體涉及一種靶向假體周圍巨噬細胞的CAR-MΦ體內外編輯制備方法及其應用。

背景技術

假體周圍關節感染(PJI)是人工關節置換術后最具破壞性的并發癥之一，是一項重大的臨床挑戰。PJI的管理需要復雜的治療策略，包括多次手術翻修和長期抗菌治療。然而，在預防和根除PJI方面取得的臨床進展甚微。盡管許多生物體都與PJI有關，但金黃色葡萄球菌，尤其是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌，仍然是最普遍和最具破壞性的致病病原體。因為植入物感染的金黃色葡萄球菌可以逃避先天和適應性宿主防御以及抗生素治療，因此，追蹤和根除植入物微環境中的金黃色葡萄球菌對于預防PJI至關重要。然而，目前仍缺乏有效的治療手段。

金黃色葡萄球菌表面蛋白A(SasA)是金黃色葡萄球菌在侵襲性感染期間存活的重要毒力因子，在臨床金黃色葡萄球菌菌株中普遍存在且高度保守。SasA能夠促進金黃色葡萄球菌與宿主細胞和組織的粘附，有助于生物膜形成。同時，通過對植入物的附著，幫助細菌逃避宿主先天免疫反應，并加速感染的進展。SasA被認為是針對金黃色葡萄球菌感染的免疫療法的潛在靶點。

巨噬細胞(MΦs)對金黃色葡萄球菌的先天免疫反應至關重要，并在病原體內化后開始發揮抗菌活性。然而，在金黃色葡萄球菌感染期間，MΦs不能有效根除內在化的金黃色葡萄球菌。這種現象主要是由于細胞內金黃色葡萄球菌觸發的caspase-11(CASP11)激活劫持了MΦs的線粒體，從而使線粒體衍生的線粒體解偶活性氧(mROS)防御機制，從而允許MΦs內的金黃色葡萄球菌抵抗mROS介導的清除。

嵌合抗原受體(CAR)是一種受體蛋白，它賦予免疫細胞新的能力，以靶向特定的抗原蛋白。嵌合抗原受體-巨噬細胞(CAR-MΦ)療法是指用特異性CARs修飾巨噬細胞(MΦs)，以提高巨噬細胞對靶細胞的吞噬活性和抗原呈遞能力。因此，利用MΦs獨特的效應子功能及其對細菌的趨化性，重定向巨噬細胞對金黃色葡萄球菌的吞噬和殺菌活性，從而為防止細菌免疫逃避并治療PJI提供了一種全新的免疫療法。

發明內容

針對現有技術的不足，本發明設計提供一種靶向假體周圍巨噬細胞的CAR-MΦ體內外編輯制備方法及其應用。通過構建殺菌性CAR巨噬細胞，實現對假體周圍金黃色葡萄球菌的高效識別、吞噬及胞內清除，提高PJI的免疫治療療效。

本發明的技術方案如下：

本發明第一方面，提供一種嵌合抗原受體，包括胞外結構域、跨膜區、胞內信號傳導結構域；所述胞外結構域前導信號肽段(Leader)、抗原識別結構域(scfv)以及鉸鏈區(Hinge)；其中，所述前導信號肽段選自CD8αLeader，所述抗原識別結構域(scFv)衍生自金黃色葡萄球菌特異性標志物SasA的單克隆抗體。

優選的，所述抗原識別結構域衍生自金黃色葡萄球菌特異性標志物SasA的單克隆抗體；賦予了CAR細胞特異性識別功能并顯著增強了對特異性抗原的親和力。

優選的，所述鉸鏈區序列來源于IgG、CD8α或CD28中的一種或多種；進一步的，所述鉸鏈區選自CD8α。

優選的，所述跨膜區來源于CD4、CD8α，CD28或CD3ζ中的一種或多種；進一步的，所述跨膜結構選自CD8α。

優選的，所述胞內結構域為信號轉導域來源于FcεRIγ或CD3ζ中的一種或多種，進一步的，所述信號傳導域為CD3ζ。