[發(fā)明專利]一種高特異性等溫核酸擴增方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202310361186.2
• 申請日: 2023-04-06
• 公開（公告）號: CN116536400A
• 公開（公告）日: 2023-08-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 申洪杰
• 申請（專利權(quán)）人: 廣州迪澳基因科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844
• 代理公司: 廣州博聯(lián)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44663
• 代理人: 梁志標(biāo)

本發(fā)明涉及一種高特異性等溫核酸擴增方法，包括以下成分的擴增體系：模板、引物組合、dNTPs、具有鏈置換活性的DNA聚合酶、核糖核酸酶H?II。靶標(biāo)核酸中，M2’和N2是位于靶序列兩端的特異性序列，M1’和N1為分別位于M2’序列和N2序列內(nèi)側(cè)的特異性序列。引物組合含擴增引物組和可選的加速引物組；擴增引物中，上游擴增引物KF包含M1’序列和與M2’互補的m2序列，即5’?M1’?m2?3’，且m2序列中至少有一個RNA堿基；下游擴增引物KR包含N1’序列和與N2的互補序列所互補的n2序列，即5’?N1’?n2?3’，且n2序列中至少有一個RNA堿基。該擴增體系可提高擴增的特異性和靈敏度。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高特異性等溫核酸擴增方法。

背景技術(shù)

等溫核酸擴增技術(shù)，例如環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(Loop-mediated?isothermalamplification)在近年來已經(jīng)取得了一定發(fā)展，由于其具有反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)時間短等優(yōu)點，在生物診斷、食品安全檢測等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

等溫核酸擴增技術(shù)具有效率高的優(yōu)點，在等溫條件下擴增15min～1h即可產(chǎn)生足夠的擴增產(chǎn)物，以滿足后續(xù)檢測的需求。然而，另一方面，在其具有擴增速度快、效率高等優(yōu)點的同時，也可能會發(fā)生引物-二聚體的擴增，在引物與引物形成二聚體、或引物與待測模板發(fā)生錯配后仍引發(fā)擴增反應(yīng)，從而導(dǎo)致假陽性結(jié)果。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種高特異性等溫核酸擴增方法，通過應(yīng)用該擴增方法，可有效減少假陽性結(jié)果，具有準(zhǔn)確性高、速度快、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點。

為此，本發(fā)明的第一方面提供一種擴增體系，所述擴增體系包括作為模板的核酸、引物組合、脫氧核糖核苷酸三磷酸、具有鏈置換活性的DNA聚合酶、核糖核酸酶(ribonuclease，RNase)HII；

所述引物組合用于對靶標(biāo)核酸進行擴增；所述靶標(biāo)核酸的3’端包括M2’序列和位于所述M2’序列5’側(cè)的M1’序列；所述靶標(biāo)核酸的5’端包括N2序列和位于所述N2序列3’側(cè)的N1序列；

其中，所述引物組合包括擴增引物組，所述擴增引物組包括上游擴增引物(KF)、下游擴增引物(KR)；

所述上游擴增引物(KF)從5’到3’方向依次包括M1’序列和m2序列，所述m2序列與所述M2’序列互補，并且所述m2序列中至少有一個核苷酸為核糖核苷酸；所述上游擴增引物(KF)的3’末端具有阻斷修飾；

所述下游擴增引物(KR)從5’到3’方向依次包括N1’序列和n2序列；所述N1’序列與所述N1序列相互補；所述n2序列與所述N2序列的互補序列相互補，并且所述n2序列中至少有一個核苷酸為核糖核苷酸；所述下游擴增引物(KR)的3’末端具有阻斷修飾。

在一些實施方式中，所述上游擴增引物(KF)中，所述M1’序列和所述m2序列直接相連；即，5’-M1’-m2-3’。

在一些實施方式中，所述下游擴增引物(KR)中，所述N1’序列和所述n2序列直接相連；即，5’-N1’-n2-3’。

在一些實施方式中，所述m2序列中，所述核糖核苷酸距所述m2序列的3’末端的距離為3～10個堿基；所述核糖核苷酸的個數(shù)為1～3個。

在一些實施方式中，所述n2序列中，所述核糖核苷酸距所述n2序列的3’末端的距離為3～10個堿基；所述核糖核苷酸的個數(shù)為1～3個。

在一些實施方式中，所述引物組合還包括加速引物組，所述加速引物組包括第一加速引物，和/或第二加速引物；