[發明專利]一種高特異性等溫核酸擴增方法

在審

• 申請號: 202310361186.2
• 申請日: 2023-04-06
• 公開（公告）號: CN116536400A
• 公開（公告）日: 2023-08-04
• 發明（設計）人: 申洪杰
• 申請（專利權）人: 廣州迪澳基因科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844
• 代理公司: 廣州博聯知識產權代理有限公司 44663
• 代理人: 梁志標

1.一種擴增體系，其特征在于，包括作為模板的核酸、引物組合、脫氧核糖核苷酸三磷酸、具有鏈置換活性的DNA聚合酶、核糖核酸酶HII；

所述引物組合用于對靶標核酸進行擴增；所述靶標核酸的3’端包括M2’序列和位于所述M2’序列5’側的M1’序列，所述靶標核酸的5’端包括N2序列和位于所述N2序列3’側的N1序列；

其中，所述引物組合包括擴增引物組，所述擴增引物組包括上游擴增引物、下游擴增引物；

所述上游擴增引物從5’到3’方向依次包括M1’序列和m2序列；所述m2序列與所述M2’序列互補，并且所述m2序列中至少有一個核苷酸為核糖核苷酸；所述上游擴增引物的3’末端具有阻斷修飾；

所述下游擴增引物從5’到3’方向依次包括N1’序列和n2序列；所述N1’序列與所述N1序列相互補；所述n2序列與所述N2序列的互補序列相互補，并且所述n2序列中至少有一個核苷酸為核糖核苷酸；所述下游擴增引物的3’末端具有阻斷修飾。

2.如權利要求1所述的擴增體系，其特征在于，所述引物組合還包括加速引物組，所述加速引物組包括第一加速引物，和/或第二加速引物；

所述上游擴增引物結合所述靶標核酸后，通過鏈置換反應合成第一核酸鏈，所述第一核酸鏈的5’端具有M1’序列和與M1’序列相互補的M1序列，所述M1’序列與所述M1序列互補形成第一環；所述第一加速引物特異性結合所述第一核酸鏈的部分區域，并且所述第一加速引物特異性結合的區域位于所述上游擴增引物和下游擴增引物的區域之外；

所述下游擴增引物結合所述第一核酸鏈后，延伸得到第二核酸鏈，所述第二核酸鏈的5’端具有N1’序列和與N1’序列互補的N1序列，所述N1’序列與所述N1序列互補形成第二環；所述第二加速引物特異性結合所述第二核酸鏈的部分區域，并且所述第二加速引物特異性結合的區域位于所述上游擴增引物和下游擴增引物的區域之外。

3.如權利要求2所述的擴增體系，其特征在于，所述第一加速引物中至少有一個核苷酸為核糖核苷酸，所述第一加速引物的3’末端具有阻斷修飾；和/或，

所述第二加速引物中至少有一個核苷酸為核糖核苷酸，所述第二加速引物的3’末端具有阻斷修飾。

4.如權利要求1～3任一項所述的擴增體系，其特征在于，所述加速引物組還包括可選的第三加速引物、第四加速引物；

所述第三加速引物、第四加速引物分別特異性所述靶標核酸或者利用所述擴增體系對靶標核酸進行擴增得到的核酸鏈；并且，所述第三加速引物、第四加速引物特異性結合的區域位于所述第一擴增引物、第二擴增引物、第一加速引物和第二加速引物的區域之外。

5.如權利要求1～4任一項所述的擴增體系，其特征在于，所述阻斷修飾包括選自雙脫氧胞苷修飾、反向dT修飾、磷酸基團修飾、間臂修飾、與靶標核酸不發生互補的核酸序列中的至少一種或其他可阻斷引物延伸的修飾。

6.如權利要求1～4任一項所述的擴增體系，其特征在于，所述具有鏈置換活性的DNA聚合酶還具有反轉錄功能；

優選地，所述DNA聚合酶為Bst聚合酶；

優選地，所述Bst聚合酶具有反轉錄功能；

優選地，所述擴增體系中，RNase?HII的酶量為5～10U；

優選地，所述擴增體系還包括緩沖溶液；所述緩沖溶液包括：Tris、KCl、MgSO₄、NaH₂PO₄、Tween、甜菜堿。

7.一種高特異性等溫核酸擴增方法，其包括提供權利要求1～6任一項所述的擴增體系；溫育所述擴增體系對所述靶標核酸進行擴增。

8.如權利要求7所述的擴增方法，其特征在于，所述溫育的溫度為60～65℃；

優選地，所述溫育的時間為15～90min。

9.一種靶標核酸的檢測方法，其特征在于，包括：以提取自待測樣本的核酸作為模板，按照權利要求7或8所述的擴增方法進行擴增并進行檢測。

10.如權利要求10所述的檢測方法，其特征在于，所述擴增體系中還包括熒光染料；所述檢測的方法包括檢測熒光值；

優選地，所述熒光染料選自下組：Sybr?Green、EvaGreen、SYTO、Boxto、Miami?Yellow。