[發明專利]一年生辣椒不同果實發育時期的內參基因及其引物和應用

在審

• 申請號: 202310352934.0
• 申請日: 2023-04-04
• 公開（公告）號: CN116656854A
• 公開（公告）日: 2023-08-29
• 發明（設計）人: 衡周;謝炳春;徐小萬;李穎;王恒明;徐曉美;李濤
• 申請（專利權）人: 廣東省農業科學院蔬菜研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 廣州專理知識產權代理事務所(普通合伙) 44493
• 代理人: 張鳳

本發明屬于辣椒基因研究的技術領域，具體涉及一年生辣椒不同果實發育時期的內參基因及其引物和應用。針對目前辣椒果實發育內參基因缺乏的現狀，依據轉錄組數據，利用實時熒光定量PCR技術對辣椒果實不同生長發育期、果實部位及組織的基因表達量進行分析的現狀，對內參基因進行廣泛篩選并使用了多種統計分析方法和綜合比較各個內參基因的穩定性，根據基因序列設計相應的實時熒光定量PCR引物，擴增效率高，篩選出一年生辣椒發育過程中穩定適合且穩定的內參基因CT8，并且開發設計了辣椒果實相關基因研究領域的實時熒光定量PCR高效擴增引物，為辣椒果實發育過程中目標基因表達分析、篩選及時空表達驗證提供了相對有效的內參基因用于校準。

技術領域

本發明屬于辣椒基因研究的技術領域，具體涉及一年生辣椒不同果實發育時期的內參基因及其引物和應用。

背景技術

實時熒光定量PCR技術因其具有高效、準確率高和重復性良好等優點被廣泛應用于基因表達量分析，但合適且穩定的內參基因是準確計算目標基因相對表達量的關鍵因素。理想狀態下，內參基因應該在同一物種、不同組織器官及其不同生長階段都能穩定表達，其表達量不受內外因素所影響。實際上，任意內參基因的表達量都是相對的，同一物種同一內參基因的表達量常常受內外因素所影響，因此在進行相關研究時應該就不同的實驗條件、實驗環境和實驗目的選擇適宜且穩定的內參基因。

辣椒是世界性蔬菜之一，也是我國種植面積最為廣泛的蔬菜作物。辣椒不僅是餐廳廚房的佐食和調料，還是化妝品、藥品和催淚瓦斯等重要產品的原料，其中一年生辣椒(Capsicum?annuum?L.)是種植最為廣泛的栽培種之一。果實品質對辣椒的商品價值至關重要，對果實發育、營養和風味相關品質性狀的基因進行時空表達量分析研究是改善植物果實品質的重要理論基礎。

2011年Hongjian?Wan等以甜椒PBC631B為材料進行內參基因篩選，研究表明β-TUB和UBI-3在所有處理中表達最穩定，不同組織器官中UBI-3和GAPDH表達穩定，ACT和UBI-1則表現出不穩定不宜做內參基因。2012年Wang?Shu?Bin等以胞質雄性不育系辣椒CMS?21A作為試驗材料。分別采取成熟植株根、莖、葉、花和非生物脅迫及激素處理幼苗，對ACT、ACT1、ACT2、18S?rRNA、PPR1、TEF1A、EF1α、UEP、CYC和GAPDH等10候選內參基因進行篩選。分析結果顯示成熟植株不同組織適宜內參基因為ACT，非生物脅迫及激素處理組適宜內參基因為EF1α，所有樣品中適宜內參基因則為EF1α和UEP。兩者選擇的同為一年生辣椒成熟植株為材料，ACT在CMS?21A成熟植株組織器官中表達穩定，適宜作為內參基因，在PBC631B成熟辣椒植株中卻不適宜作為內參基因使用。因此，如果仍使用缺乏系統驗證的ACT作為內參基因將會嚴重影響辣椒果實發育相關基因表達分析的準確性；另一方面，隨著轉錄組的測序的迅猛發展，基于轉錄組數據篩選開發出穩定適宜的新內參基因是解決當前困境的良好選擇。

發明內容

針對上述問題，本發明的目的在于提供一年生辣椒(Capsicum?annuum?L.)不同果實發育時期的內參基因及其引物和應用，所篩選的內參基因滿足對辣椒果實發育過程中相關基因研究的數據支撐。

本發明的技術內容如下：

本發明提供了一年生辣椒(Capsicum?annuum?L.)不同果實發育時期的內參基因，所述內參基因為EIF，其核酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，其特異性引物如SEQ?ID?NO.30和SEQID?NO.31所示。

本發明還提供了上述內參基因CT8或其特異性引物在制備一年生辣椒不同果實發育時期檢測試劑盒的應用。

本發明還提供了一年生辣椒不同果實發育時期的內參基因的篩選方法，包括如下步驟：

1)果實預處理：獲取不同生長發育時期的一年生辣椒果實，研磨成粉末；

2)提取RNA：提取不同生長發育時期的辣椒果實粉末的RNA；