[發明專利]一種大鰭鳠精子高效超低溫冷凍保存方法

在審

• 申請號: 202310347626.9
• 申請日: 2023-04-04
• 公開（公告）號: CN116491496A
• 公開（公告）日: 2023-07-28
• 發明（設計）人: 胡鵬;蘇建;文正勇;王均;史慶超;呂云云
• 申請（專利權）人: 內江師范學院;四川省內江市農業科學院
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02
• 代理公司: 山東道智永盛知識產權代理事務所(普通合伙) 37407
• 代理人: 王洋洋

本發明屬生物技術領域，具體地說是一種大鰭鳠精子超低溫冷凍保存的方法。選取精巢發育為V期的的大鰭鳠雄魚，解剖取出其精巢，經過處理研磨過濾后，將大鰭鳠的精液與稀釋液、抗凍保護劑按比例混合，震蕩預冷后經過冰箱、干冰降溫處理，最終投入到液氮(?196℃)，分裝保存。解凍時采用冰箱預熱法，最終檢測精子活力與鮮精差異不顯著。本發明獲得的凍精對于大鰭鳠人工繁育、種質保存、遺傳多樣性保護及可持續養殖等方面有著重要意義。

技術領域

本發明屬生物技術領域，具體地說是一種大鰭鳠精子高效超低溫冷凍保存方法。

技術背景

大鰭鳠(Mystus?macropterus)，俗稱石板條、石扁頭、石胡子等，屬鯰形目、鲿科、鳠屬，主要分布于我國長江水系和珠江水系的干流及其支流中，是一種生長較快、棲息于江河中下層，以底棲動物為食的特產經濟鯰類。大鰭鳠肉質細嫩、味道鮮美、無肌間刺，營養價值高，市場需求旺盛，售價高到250-300元/公斤，養殖推廣前景廣闊。

規模化苗種培育是大鰭鳠開發利用的前提和基礎，但其雌雄性腺發育不同步，且雄魚精巢呈樹枝狀分支，精巢發育差而導致精液難以擠出，從而影響苗種生產。為解決這一難題，本發明提供一種大鰭鳠精子高效超低溫冷凍保存方法，以便在其人工繁育過程中及時供給優質精子，保證苗種生產效率。魚類精液的超低溫保存在水產養殖、遺傳育種以及種質資源保存中具有重要的意義：可以使種質的長距離運輸得以實現，有利于魚類的雜交、選育以及基因多樣性的保護。隨著經濟的飛速發展及水污染的日益加劇，重要淡水養殖優良品種種質保存已成為淡水養殖業中亟待解決的問題。建立大鰭鳠精子的超低溫冷凍技術，無論是對其遺傳多樣性的保護，還是開展生物技術育種以及淡水養殖業的可持續發展，都有著迫切的需求。

發明內容

本發明的目的在于提供一種大鰭鳠精子高效超低溫冷凍保存方法。

為實現上述目的，本發明采取的技術方案為：

選取精巢發育為V期的的大鰭鳠雄魚，取出精巢，摘除精巢兩側血管，放入加有1％青鏈霉素混合液的4℃生理鹽水中浸潤45-60秒；加入DMEM/F12細胞培養液，4℃條件下研磨精巢2min，將分散后的組織液轉移至離心管中，離心去上清液；300目的細胞篩過濾，去掉組織殘渣，收集濾液，檢測精子活力，活力高于90％，用于后續實驗；

將收集到的精液加入依次加入稀釋液、抗凍保護劑，振蕩器震蕩混勻2min。

所述稀釋液由NaBrO3、MgF2、麥芽糖醇和胎牛血清組成：制備方法為取NaBrO32.5g，MgF21.5g，麥芽糖醇6.0g，胎牛血清12mL，溶于400mL雙蒸水，定容至500mL，即成稀釋液。

所述抗凍保護劑為丙酮和二甲基甲酰胺按照1:1體積比(V/V)的混合液。

取新鮮的大鰭鳠精液1mL，按照1:9的體積比(V/V)加入到9mL稀釋液液中，4℃旋渦震蕩30s，移液槍吸取2mL混合液加入到2.5mL的凍存管中，加入400μL抗凍保護劑，4℃旋渦震蕩30s，放入4℃冰箱中預冷12min。

將預冷后的裝有混合液凍存管放入-20℃冰箱中冷凍2min，迅速取出放入干冰中冷凍5min，最后將凍存管直接投入到液氮中長期冷凍保存。

將分裝保存于液氮中的大鰭鳠凍精進行解凍，具體方法為：解凍時用鑷子將凍存管從液氮中取出，放入-20℃冰箱中預熱1min，然后迅速將凍存管放入50℃恒溫水浴鍋中水浴解凍10s后迅速取出，任其自由解凍。

吸取精液，用Actifish淡水魚精子活力激活液激活，鏡檢其活力，檢測精子運動率等指標，判斷精子冷凍保存效果。

本發明與現有技術相比，具有如下有益效果：

一、本發明采用解剖取精巢收集精子方法，克服了大鰭鳠雄魚精巢呈樹枝狀分支，精巢發育差且精液難以擠出的弊端，對于大鰭鳠精子收集具有很好的效果。