[發明專利]一種大鰭鳠精子高效超低溫冷凍保存方法

在審

• 申請號: 202310347626.9
• 申請日: 2023-04-04
• 公開（公告）號: CN116491496A
• 公開（公告）日: 2023-07-28
• 發明（設計）人: 胡鵬;蘇建;文正勇;王均;史慶超;呂云云
• 申請（專利權）人: 內江師范學院;四川省內江市農業科學院
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02
• 代理公司: 山東道智永盛知識產權代理事務所(普通合伙) 37407
• 代理人: 王洋洋

1.一種大鰭鳠精子高效超低溫冷凍保存方法，其特征在于：

選取精巢發育為V期的的大鰭鳠雄魚，取出精巢，摘除精巢兩側血管，放入加有1％青鏈霉素混合液的4℃生理鹽水中浸潤45-60秒；加入DMEM/F12細胞培養液，4℃條件下研磨精巢2min，將分散后的組織液轉移至離心管中，離心去上清液；300目的細胞篩過濾，去掉組織殘渣，收集濾液中精子細胞，檢測精子活力，活力高于90％，用于后續實驗。

將收集到的精液加入依次加入稀釋液、抗凍保護劑，稀釋后振蕩器震蕩混勻預冷，利用冰箱、干冰、液氮分步降溫，最終解凍激活。

2.按權利要求1所述的大鰭鳠精子高效超低溫冷凍保存方法，其特征在于：所述稀釋液由NaBrO3、MgF₂、麥芽糖醇和胎牛血清組成：制備方法為取NaBrO32.5g，MgF₂1.5g，麥芽糖醇6.0g，胎牛血清12mL，溶于400mL雙蒸水，定容至500mL，即成稀釋液。

3.按權利要求1所述的大鰭鳠精子高效超低溫冷凍保存方法，其特征在于：所述抗凍保護劑為丙酮和二甲基甲酰胺按照1:1體積比(V/V)的混合液。

4.按權利要求1所述的大鰭鳠精子高效超低溫冷凍保存方法，其特征在于：所述稀釋后振蕩器震蕩混勻預冷，即取新鮮的大鰭鳠精液1mL，按照1:9的體積比(V/V)加入到9mL稀釋液液中，4℃旋渦震蕩30s，移液槍吸取2mL混合液加入到2.5mL的凍存管中，加入400μL抗凍保護劑，4℃旋渦震蕩30s，放入4℃冰箱中預冷12min。

5.按權利要求1所述的大鰭鳠精子高效超低溫冷凍保存的方法，其特征在于：所述利用冰箱、干冰、液氮分步降溫，即將預冷后的裝有混合液凍存管放入-20℃冰箱中冷凍2min，迅速取出放入干冰中冷凍5min，最后將凍存管直接投入到液氮中長期冷凍保存。

6.按權利要求1所述的大鰭鳠精子高效超低溫冷凍保存方法，其特征在于：所述解凍為將分裝保存于液氮中的大鰭鳠凍精進行解凍，具體方法為，解凍時用鑷子將凍存管從液氮中取出，放入-20℃冰箱中預熱1min，然后迅速將凍存管放入50℃恒溫水浴鍋中水浴解凍10s后迅速取出，任其自由解凍。

7.按權利要求1所述的大鰭鳠精子高效超低溫冷凍保存方法，其特征在于：所述激活為吸取精液，用Actifish淡水魚精子活力激活液激活，鏡檢其活力，檢測精子運動率等指標，判斷精子冷凍保存效果。