[發(fā)明專利]一種用于新型冠狀病毒S基因6種突變位點(diǎn)檢測(cè)的引物探針組合

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202310343573.3
• 申請(qǐng)日: 2023-03-31
• 公開（公告）號(hào): CN116479177A
• 公開（公告）日: 2023-07-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 賀華;張蓉;郭玉婉;黃青紅;王珊;張少鐸;袁威;劉中華;王國(guó)強(qiáng)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江蘇碩世生物科技股份有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/6858;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 上海鍛創(chuàng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31448
• 代理人: 顧繼光

本發(fā)明涉及一種用于新型冠狀病毒S基因6種突變位點(diǎn)檢測(cè)的引物及探針組合。本發(fā)明采用ARMS法(擴(kuò)增受阻突變系統(tǒng))以新冠S基因?yàn)榘行蛄校O(shè)計(jì)69?70del缺失位點(diǎn)、E484K位點(diǎn)、K417N位點(diǎn)、N501Y位點(diǎn)、P681H位點(diǎn)、K417T位點(diǎn)的突變型引物，以O(shè)RF1ab基因(內(nèi)控)為靶序列設(shè)計(jì)引物，探針采用不同熒光進(jìn)行標(biāo)記。根據(jù)突變型和內(nèi)控基因熒光PCR檢測(cè)Ct值的差異(ΔCt)實(shí)現(xiàn)對(duì)冠狀病毒S基因69?70del、E484K、K417N、N501Y、P681H、K417T位點(diǎn)突變檢測(cè)。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)特異性強(qiáng)；(2)靈敏度高；(3)成本低，通量高；(4)快速省時(shí)，準(zhǔn)確性高；(5)操作簡(jiǎn)單。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于病毒檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于新型冠狀病毒S基因6種突變位點(diǎn)檢測(cè)的引物探針組合。

背景技術(shù)

SARS-CoV-2是單股正鏈RNA病毒，直徑60～140nm，具有5個(gè)必需基因，分別針對(duì)核蛋白(N)、病毒包膜(E)、基質(zhì)蛋白(M)和刺突蛋白(S)4種結(jié)構(gòu)蛋白及RNA依賴性的RNA聚合酶(RdRp)。S蛋白是重要的結(jié)構(gòu)蛋白，S蛋白上的特定位點(diǎn)的突變，影響病毒與人體細(xì)胞的親和力，改變病毒的傳染性和致病性，在病毒傳播中起著十分重要的作用。對(duì)S基因突變病毒的快速鑒定有助于進(jìn)一步監(jiān)控病毒的傳播及演化進(jìn)程。因此，必須建立快速、靈敏的突變基因檢測(cè)方法才能實(shí)現(xiàn)新型冠狀病毒S基因突變體的快速有效鑒定。

WHO提出的VOI是指出現(xiàn)可能或已知影響傳染性、疾病嚴(yán)重程度、免疫逃逸、診斷和治療的特異位點(diǎn)突變的病毒株，在多個(gè)國(guó)家的相對(duì)流行率不斷增加，全球公共衛(wèi)生面臨新的風(fēng)險(xiǎn)。VOC是指符合VOI定義，經(jīng)評(píng)估證實(shí)存在以下至少一種特點(diǎn)的變異株：①病毒傳染性增加；②致病性增強(qiáng)或臨床癥狀改變；③公共衛(wèi)生及社會(huì)措施或診斷、疫苗、治療方法的有效性降低。目前指定的VOCs有Delta、Omicron變異株，其中Omicron變異株于2021年9月下旬，在南非發(fā)現(xiàn)。該突變體有多個(gè)刺突蛋白缺失和突變，新冠病毒奧密克戎變異株在病毒刺突(Spike)蛋白突變較多，同時(shí)具有前4個(gè)變異株Alpha、Beta、Gamma和Delta刺突蛋白的重要氨基酸突變位點(diǎn)，包括增強(qiáng)細(xì)胞受體親和力和病毒復(fù)制能力的突變位點(diǎn)，導(dǎo)致其具有極強(qiáng)的傳播能力。Alpha(B.1.1.7)變異株共有17個(gè)突變，其中S蛋白上有9個(gè)突變：Δ69/70、Δ144、N501Y、A570D、D614G、P681H、T716I、S982A、D1118H，另外也可能合并E484K、S494P和K1191N。N501Y的突變是S蛋白R(shí)BD第501位氨基酸由天冬氨酸(N)突變?yōu)槔野彼?Y)，該突變不僅改變RBD構(gòu)象使SARS-CoV-2對(duì)人體ACE2受體親和力增加，還可增加病毒粒子與精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸基序(RGD?motif)結(jié)合位點(diǎn)的親和力。Δ69/70影響RBD構(gòu)象，疊加增強(qiáng)S蛋白對(duì)ACE2受體親和力，增強(qiáng)病毒傳染性并有助于病毒發(fā)生免疫逃逸，這種缺失也是某些檢測(cè)試劑盒未能檢測(cè)到病毒S基因的原因。S蛋白只有被切割，暴露出開放結(jié)構(gòu)區(qū)域，才能與人體ACE2受體結(jié)合。P681H是S蛋白受體S1和S2區(qū)域連接處的弗林蛋白酶切割位點(diǎn)的一部分。該連接處的變化增強(qiáng)了S蛋白上切割位點(diǎn)對(duì)蛋白酶的敏感性，能明顯提高病毒的傳播效率。B.1.351變異株的S蛋白上具備8個(gè)突變或位點(diǎn)缺失：D80A、D215G、Δ241/242/243、K417N、E484K、N501Y、D614G和A701V。N501Y及K417N、E484K突變，都可改變RBD構(gòu)象，增強(qiáng)與ACE2受體親和力，增加傳染性。Gamma(P.1)變異株的S蛋白上存在11個(gè)突變，除D614G外，還包括RBD中的K417T、E484K和N501Y；NTD中的L18F、T20N、P26S、D138Y和R190S；和靠近Furin裂解位點(diǎn)的H655Y。研究人員總結(jié)了歐洲多個(gè)國(guó)家COVID-19病例并分析了B.1.1.7、B.1.351和P.1的臨床特點(diǎn)，感染這三種變異株病例的住院率顯著高于非VOC病例，入住ICU的可能性分別是非VOC病例的2.3、3.3和2.2倍，并顯示在各年齡段有病情加重風(fēng)險(xiǎn)。因此，確定S蛋白的突變類型，快速識(shí)別多種SARS-CoV-2變異株，可以防止?jié)撛诘膹V泛感染和變異的流入。