[發明專利]一種用于新型冠狀病毒S基因6種突變位點檢測的引物探針組合

在審

• 申請號: 202310343573.3
• 申請日: 2023-03-31
• 公開（公告）號: CN116479177A
• 公開（公告）日: 2023-07-25
• 發明（設計）人: 賀華;張蓉;郭玉婉;黃青紅;王珊;張少鐸;袁威;劉中華;王國強
• 申請（專利權）人: 江蘇碩世生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6858;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 上海鍛創知識產權代理有限公司 31448
• 代理人: 顧繼光

1.一種用于新型冠狀病毒S基因6種突變位點檢測的引物探針組合，其特征在于，所述引物探針組合包括檢測S基因6個位點的特異性引物探針，所述S基因6個位點為69-70del、E484K、K417N、N501Y、P681H、K417T位點；

69-70del位點特異性引物探針，正向引物序列為SEQ?ID?No.3；反向引物序列為SEQ?IDNo.6；探針序列為SEQ?ID?No.7；

E484K位點特異性引物探針，正向引物序列為SEQ?ID?No.9；反向引物序列為SEQ?IDNo.13；探針序列為SEQ?ID?No.14；

K417N位點特異性引物探針，正向引物序列為SEQ?ID?No.16；反向引物序列為SEQ?IDNo.17；探針序列為SEQ?ID?No.18；

N501Y位點特異性引物探針，正向引物序列為SEQ?ID?No.19；反向引物序列為SEQ?IDNo.23；探針序列為SEQ?ID?No.26；

P681H位點特異性引物探針，正向引物序列為SEQ?ID?No.28；反向引物序列為SEQ?IDNo.32；探針序列為SEQ?ID?No.35；

K417T位點特異性引物探針，正向引物序列為SEQ?ID?No.37；反向引物序列為SEQ?IDNo.38；探針序列為SEQ?ID?No.39。

2.根據權利要求1所述的引物探針組合，其特征在于，引物探針組合還包括ORF1ab基因的特異性引物探針，正向引物序列為SEQ?ID?No.40；反向引物序列為SEQ?ID?No.41；探針序列為SEQ?ID?No.42。

3.根據權利要求1所述的引物探針組合，其特征在于，引物探針組合還包括內標RNaseP基因的特異性引物探針，正向引物序列為SEQ?ID?No.43；反向向引物序列為SEQ?ID?No.44；探針序列為SEQ?ID?No.45。

4.根據權利要求1所述的引物探針組合，其特征在于，引物為ARMS引物，其3’末端堿基與突變位點處堿基互補；特異性探針的兩端分別帶有熒光基團和淬滅基團；光基團選自FAM、HEX、VIC、TET、TAMRA、ROX、CY3.5、CY5中的任意一種或幾種；淬滅基團選自BHQ1、BHQ2、BHQ3、DABCYL、MGB中的任意一種或幾種。

5.一種用于新型冠狀病毒S基因6種突變的檢測試劑盒，包括以下組分：核酸擴增反應液、酶混合液、權利要求1所述的引物探針組合、去RNA酶水。

6.根據權利要求5所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述核酸擴增反應液包括PCR緩沖液、MgCl₂、dNTPs。

7.根據權利要求5所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述酶混合液包括RNA酶抑制劑、DNA聚合酶、逆轉錄酶。

8.根據權利要求5所述的檢測試劑盒，其特征在于，檢測液中的引物探針組合，引物濃度為0.005～1.0μmol；探針濃度為0.005～1.0μmol。

9.一種用于新型冠狀病毒S基因6種突變檢測的方法，其特征在于，具體包括如下步驟：

S1、模板RNA的提取：樣本核酸提取；

S2、配制試劑反應體系：

按照以下組成配制，將核酸擴增反應液、酶混合液及如權利要求1所述引物探針組合配制成混合液，分裝，加入模板RNA，用去RNA酶水補足至50微升，充分混勻，離心，放入熒光PCR儀；

反應體系為50μL，組成如下：

S3、設置擴增程序并檢測：

進行RT-PCR擴增，結果判讀。

10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于，結果判讀具體為：

(1)陰陽性判定：

內標RNaseP，Ct≤37.0時檢測結果可靠，新型冠狀病毒ORF1ab，Ct≤40.0為2019-nCov陽性；S基因突變位點，Ct≤40.0且與ORF1ab的ΔCt8.0則該位點為陽性，即突變型，否則為陰性，即野生型；

(2)變異株型別判定：

針對檢測為陽性的位點，即突變位點進行變異株型別判定，變異株Alpha含有69-70del、N501Y、P681H突變，變異株Beta含有E484K、K417N、N501Y突變，變異株Gamma含有E484K、N501Y、K417T突變，變異株Omicron含有K417N、N501Y、P681H突變或K417N、N501Y、P681H、69-70del突變。