[發明專利]一種從梅花鹿糞便中提取宿主核基因組DNA的方法及其應用

在審

• 申請號: 202310336067.1
• 申請日: 2023-03-31
• 公開（公告）號: CN116179541A
• 公開（公告）日: 2023-05-30
• 發明（設計）人: 張陽;黃曉鳳;韓衛杰;張天祥;張曼玉
• 申請（專利權）人: 江西省林業科學院
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/6806
• 代理公司: 南昌大牛知識產權代理事務所(普通合伙) 36135
• 代理人: 劉俊文

本發明屬于分子生物學技術領域，具體涉及一種從梅花鹿糞便中提取宿主核基因組DNA的方法。該方法將梅花鹿糞便樣品置于無水乙醇中，然后進行離心震蕩洗脫，得到洗脫液；向洗脫液中加入醋酸鈉溶液，混勻，離心，得到富集的梅花鹿腸壁細胞及破碎腸壁細胞釋放的宿主DNA；然后通過75％乙醇清洗，離心，干燥，得到收集物；最后使用微量DNA提取試劑盒從收集物中提取梅花鹿核基因組DNA。本發明的方法操作簡單，高效可靠，耗時短，成本低，通過使用無水乙醇對梅花鹿糞便表明附著的腸壁細胞進行洗脫，顯著增加了梅花鹿腸壁細胞及其DNA的收集量，同時在洗脫過程保證糞球的完整性，最大限度減少了細菌DNA對梅花鹿核基因組DNA的污染。

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，具體涉及一種從梅花鹿糞便中提取宿主核基因組DNA的方法。

背景技術

梅花鹿(Cervusnippon)隸屬于偶蹄目(Artiodactyla)鹿科(Cervidae)鹿屬，是東亞季風區特產鹿類，國際瀕危物種，我國I級保護動物。歷史上，梅花鹿曾廣泛分布于亞洲東北部，共記錄有13個亞種。我國曾分布有6個亞種，分別為山西亞種(C.n.grassianus)、河北亞種(C.n.mandarinus)、東北亞種(C.n.hortulorm)、四川亞種(C.n.sichaunicus)、華南亞種(C.n.kopschi)和臺灣亞種(C.n.taioanus)。其中山西亞種、河北亞種和臺灣亞種的野外種群已經滅絕，我國目前僅存東北亞種、四川亞種和華南亞種3個亞種，總數量1000余只，且零散分布于我國四川、江西、浙江等省的狹窄區域，分布區相互隔離。在種群數量上，除四川鐵布保護區和江西桃紅嶺保護區的種群外，其它種群均低于理論最小種群數500只，依然面臨種群滅絕風險。因此，開展野生梅花鹿種群保護遺傳學研究，對于掌握其種群遺傳結構和遺傳變異水平，從而制定精確有效的保護管理措施，確保其種群健康快速發展具有重要意義。目前國內對于梅花鹿種群遺傳多樣性的研究幾乎只限于東北亞種的人工飼養種群，野生梅花鹿種群由于血液、肌肉等組織樣品采集困難，其保護遺傳學研究難以全面深入開展。

近年來，非損傷性取樣因為可以在不傷害野生動物的情況下獲取分析所需的DNA，因此在野生動物保護遺傳學、分子生態學和分子進化等領域獲得了廣泛應用。其是指在不捕獲、觸及，甚至在未見到動物的情況下，收集動物毛發、糞便、尿液、脫落羽毛、含口腔脫落細胞的食物殘渣、鱗片以及卵殼等樣品，從中獲取動物DNA的方法。有研究表明，每克哺乳動物糞便中含有1×10⁵～1×10⁶個宿主腸壁細胞，且大部分腸壁細胞依然保持完整，因此糞便是在不損傷野生哺乳動物條件下獲取其遺傳物質的有效途徑。但動物糞便樣品的成分相較于血液和組織樣品復雜的多，其包含了大量的食物殘渣和細菌，宿主脫落的腸壁細胞只占其中極其微小的一部分。所以直接從糞便中提取的DNA只含有極少量的宿主DNA，而且其中包含了多種PCR反應抑制物質，因此難以直接應用于宿主的遺傳學分析。