[發明專利]一種具有在人腸道中占據高豐度潛力雙歧桿菌菌株的篩選方法

在審

• 申請號: 202310334683.3
• 申請日: 2023-03-31
• 公開（公告）號: CN116397001A
• 公開（公告）日: 2023-07-07
• 發明（設計）人: 翟齊嘯;李劉若蘭;于雷雷;田豐偉;陸文偉;崔樹茂;王剛;趙建新;陳衛;張灝
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12Q1/04
• 分類號: C12Q1/04;C12Q1/06;C12R1/01
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 趙巧娜

本發明公開了一種具有在人腸道中占據高豐度潛力雙歧桿菌菌株的篩選方法，屬于微生物技術領域。本發明主要針對長雙歧桿菌這一已知的在雙歧桿菌屬內占據豐度優勢的菌種進行生理特性的探究，將碳水化合物利用、含氮化合物利用以及對腸道上皮細胞黏附能力與豐度進行關聯，找到與豐度顯著相關的10個碳水化合物，6種含氮化合物以及2種黏附能力的篩選指標，并經過小鼠糞便實驗和人類糞便體外發酵實驗驗證，證明了該篩選方法的可行性。本發明證實了該篩選方法篩選出來的雙歧桿菌在小鼠和人類的糞便中均能占據豐度優勢，并且菌種利用碳源的ODsubgt;600nm/subgt;值和代時可以作為關鍵的篩選依據。本發明可以對未來微生態制劑的菌種選育提供新的方案和思路。

技術領域

本發明具體涉及一種具有在人腸道中占據高豐度潛力雙歧桿菌菌株的篩選方法，屬于微生物技術領域。

背景技術

腸道菌群參與了人體內復雜的生理代謝過程，對于免疫防御的建立，神經系統甚至人類行為產生影響。當穩態的腸道菌群被破壞后，它們可能參與了誘發如肥胖、糖尿病、炎癥性腸病(IBD)、腸易激綜合征(IBS)等疾病的過程。因此，腸道微生物的種類和豐度保持相對穩定與人類的健康緊密相關。

雙歧桿菌是人類腸道益生菌的代表，是公認的重要的益生菌，在人腸道中所占豐度較高，作為益生菌制劑在食品和藥品中得到了廣泛的應用。但雙歧桿菌作為外源菌攝入可能會出現定殖時間短而無法長久發揮益生功效等問題，并且益生效果具有菌株特異性。有研究發現，各個雙歧桿菌種在腸道中的豐度都隨不同的飲食、年齡等狀態的變化而呈現個體化特征。影響益生菌在人體腸道內豐度的因素可以分為宿主因素、環境因素以及菌株自身特異性三方面。其中，菌株自身特異性包括菌株對碳源、氮源的利用能力，對腸道上皮細胞的黏附能力等。

目前，檢測腸道微生物的方法主要有傳統培養法、聚合酶鏈式反應技術、熒光原位雜交、基因芯片、宏基因組測序技術等，研究人員以不同的目標為導向選擇了不同的腸道微生物的篩選方法，如為了篩選低豐度擬桿菌而采用選擇性培養基進行培養達到分離和富集所需菌種，或者使用宏基因組分析嬰兒腸道內菌群豐度的動態變化后對腸道產酸微生物進行分離、純化和鑒定，并檢測了分離菌株的病原菌抑制作用、耐藥性及抗生素敏感性，等等。具有定殖能力的雙歧桿菌的篩選方法也是從基因層面展開的，有研究人員通過高通量DNA測序篩選宿主的全基因組中促進定殖的基因，研究人員需要得到菌株的基因草圖，確定其是否具有影響定殖能力的基因位點。檢測雙歧桿菌的定殖能力則需要進行長期跟蹤的人群實驗或者動物實驗，通過設計在復雜樣本中的特異性定量檢測技術追蹤攝入后的雙歧桿菌定殖情況，整個實驗過程比較繁瑣、耗時較長。

但是如果能將宏基因組數據與菌株生理特性的體外實驗數據相結合，找到與宏基因組數據中相關性極強的實驗指標，則能使快速篩選具有占據豐度優勢潛力的菌株成為可能。本發明首次提出使用代時、OD_600nm及細胞黏附方法的組合來精準篩選具有高豐度潛力的雙歧桿菌株，目前并沒有篩選高豐度雙歧桿菌菌株的方法出現，菌株在不同培養基中的代時和生長量具有顯著差異，這也就使得其具備了篩選的條件，本發明首先證明了使用的篩選指標的科學性和可行性，其次使用本篩選方法能較其他方法更快速地、低成本地篩選出具備高豐度潛力的雙歧桿菌菌株，甚至可以推廣到提出一種篩選具有在腸道中占高豐度的潛力的菌株的方法，這對益生菌的應用是可以提供理論支持的。

發明內容

本發明通過對長雙歧桿菌這一已知在人腸道中占據屬內豐度優勢的雙歧桿菌進行機制探究，找到造成長雙歧桿菌占據屬內豐度優勢的關鍵因素并進行實驗驗證，進而總結出一種篩選在人腸道內具有高豐度潛力雙歧桿菌菌株的方法；本發明提供了一種篩選在人腸道內占據高豐度潛力的雙歧桿菌菌株的方法，所述方法為通過對菌株各項生理特性指標的實驗及驗證來預測其經攝入后在人腸道內是否能占據高豐度。

在本發明的一種實施方式中，所述生理特性指標的實驗是碳源利用表型實驗、氮源利用表型實驗、對腸道上皮細胞的單菌以及競爭黏附能力實驗等4項實驗。