[發明專利]一種具有在人腸道中占據高豐度潛力雙歧桿菌菌株的篩選方法

在審

• 申請號: 202310334683.3
• 申請日: 2023-03-31
• 公開（公告）號: CN116397001A
• 公開（公告）日: 2023-07-07
• 發明（設計）人: 翟齊嘯;李劉若蘭;于雷雷;田豐偉;陸文偉;崔樹茂;王剛;趙建新;陳衛;張灝
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12Q1/04
• 分類號: C12Q1/04;C12Q1/06;C12R1/01
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 趙巧娜

1.一種在人腸道中占據高豐度潛力雙歧桿菌菌株的篩選方法，其特征在于，所述方法為：

(1)雙歧桿菌的初步篩選

1)將待篩選的雙歧桿菌菌株在液體mMRS培養基中培養2～3代，離心重懸；

2)將步驟1)重懸后的雙歧桿菌接入將碳源替換為D-木糖的加有溴甲酚紫酸堿指示劑的液體mMRS培養基中，進行培養后，觀察顏色變化，若顏色變黃則認為達標，為指標1；

3)將步驟1)重懸后的雙歧桿菌接入將碳源替換為低聚果糖的加有溴甲酚紫酸堿指示劑的液體mMRS培養基中，進行培養后，觀察顏色變化，若顏色變黃則認為達標，為指標2；

在任一碳源培養基中變黃的菌株進入下一輪實驗；

(2)雙歧桿菌的復篩

1)將步驟(1)初篩后得到的雙歧桿菌采用熒光染色法檢測單株雙歧桿菌對腸道上皮細胞HT-29的單黏附能力，單黏附能力≤0.27％達標；為指標3；

2)將步驟(1)初篩后得到的雙歧桿菌采用絕對定量法檢測不同種菌株對腸道上皮細胞HT-29的競爭黏附能力，競爭黏附能力≤4.3×10⁵CFU/mL達標，為指標4；

3)將步驟(1)初篩后得到的雙歧桿菌分別接入到替換了不同碳源的mMRS液體培養基中，在37℃厭氧條件進行培養24～48h；分別檢測以下指標：

a、在碳源為D-木糖的培養基中進行培養后，檢測代時、OD_600nm；代時為94～705min或第24h的OD_600nm≥0.19達標，為指標5和6；

b、在碳源為低聚果糖的培養基中進行培養后，檢測代時、OD_600nm；代時為68～139min或第24h的OD_600nm≥0.78達標，為指標7和8；

c、在碳源為葡萄糖的培養基中進行培養后，檢測代時、OD_600nm；代時為55～141min或第24h的OD_600nm≥0.83達標，為指標9和10；

d、在碳源為菊粉的培養基中進行培養后，檢測代時、OD_600nm；代時為75～152min或第24h的OD_600nm≥0.65達標，為指標11和12；

e、在添加了溴甲酚紫的碳源為蔗糖的培養基中進行培養后，若顏色變黃則認為達標，為指標13；將變黃的菌株轉移至碳源為蔗糖的培養基中培養，檢測OD_600nm；第24h的OD_600nm≥0.77達標，為指標14；

f、在添加了溴甲酚紫的碳源為低聚半乳糖的培養基中進行培養后，若顏色變黃則認為達標，為指標15；將變黃的菌株轉移至碳源為低聚半乳糖的培養基中培養，檢測OD_600nm；第24h的OD_600nm≥0.96達標，為指標16；

g、在添加了溴甲酚紫的碳源為乳糖的培養基中進行培養后，若顏色變黃則認為達標，為指標17；將變黃的菌株轉移至碳源為乳糖的培養基中培養，檢測OD_600nm；第24h的OD_600nm≥1.00達標，為指標18；

h、在添加了溴甲酚紫的碳源為D-半乳糖的培養基中進行培養后，若顏色變黃則認為達標，為指標19；將變黃的菌株轉移至碳源為D-半乳糖的培養基中培養，檢測OD_600nm；第24h的OD_600nm≥0.63達標，為指標20；

i、在添加了溴甲酚紫的碳源為D-麥芽糖的培養基中進行培養后，若顏色變黃則認為達標，為指標21；

j、在添加了溴甲酚紫的碳源為海藻糖的培養基中進行培養后，若顏色變黃則認為達標，為指標22；

4)將步驟(1)初篩后得到的雙歧桿菌分別接入到含有不同氮源的氮源培養基中，在37℃厭氧條件進行培養48h；分別檢測以下指標：

k、在氮源為復合氮源的氮源培養基中進行培養后，檢測OD_600nm；第48h的OD_600nm≥0.26達標，為指標23；所述復合氮源為胰蛋白胨、牛肉膏和酵母粉；

l、在氮源為酵母浸粉FM818的氮源培養基中進行培養后，檢測OD_600nm；第48h的OD_600nm≥0.34達標，為指標24；

m、在氮源為酵母浸粉FM888的氮源培養基中進行培養后，檢測OD_600nm；第48h的OD_600nm≥0.36達標，為指標25；

n、在氮源為酵母蛋白胨的氮源培養基中進行培養后，檢測OD_600nm；第48h的OD_600nm≥0.32達標，為指標26；

o、在氮源為酵母提取物的氮源培養基中進行培養后，檢測OD_600nm；第48h的OD_600nm≥0.36達標，為指標27；

(3)判斷在人腸道中占據高豐度潛力雙歧桿菌菌株：按照步驟(1)～(2)的方法，檢測上述27個指標，將至少符合17個指標的菌株，判斷為人腸道中占據高豐度潛力雙歧桿菌菌株。