[發(fā)明專利]一種具核梭桿菌外膜囊泡的提取純化方法及應(yīng)用

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• 申請日: 2023-03-30
• 公開（公告）號: CN116240145A
• 公開（公告）日: 2023-06-09
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 權(quán)春善;張麗影;張旭強;鄭維;王豫鑫;范若辰;葛樹愛;吳亞芳;胡展馳
• 申請（專利權(quán)）人: 大連民族大學(xué)
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N1/02;A61K39/40;A61K35/74;A61P35/00;A61P29/00;C12R1/01
• 代理公司: 北京東方盛凡知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11562
• 代理人: 陳月霞

本發(fā)明公開了一種具核梭桿菌外膜囊泡的提取純化方法及應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明首先利用超速離心法對外膜囊泡進行粗提取，獲得粗提外膜囊泡，再制作碘克沙醇密度梯度溶液，利用密度梯度法對粗提的外膜囊泡進行純化，最終得到純化的外膜囊泡。本發(fā)明將超速離心技術(shù)和碘克沙醇密度梯度離心技術(shù)相結(jié)合，有效解決了具核梭桿菌外膜囊泡提取量少、毒性雜質(zhì)存留的問題。細胞實驗結(jié)果表明，本發(fā)明純化的具核梭桿菌外膜囊泡對人正常結(jié)直腸上皮細胞毒性低，同時能促進其釋放促炎因子IL?8，利用其制備的抗體能夠顯著降低具核梭桿菌對結(jié)直腸癌細胞的黏附。本發(fā)明為制備促進釋放促炎因子藥物以及疫苗開發(fā)方面的應(yīng)用提供技術(shù)基礎(chǔ)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種具核梭桿菌外膜囊泡的提取純化方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)

近年來，結(jié)直腸癌嚴重影響人類身體健康。結(jié)直腸癌最常用的預(yù)防策略是化學(xué)預(yù)防，如服用阿司匹林和其他非甾體抗炎藥，然而長期使用阿司匹林(或其他非甾體抗炎藥)會導(dǎo)致不良反應(yīng)，包括胃出血、腹痛、消化不良、惡心和嘔吐等，并且還會產(chǎn)生耐藥性，因此迫切需要更為安全的替代方法。研究表明，具核梭桿菌與結(jié)直腸癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移直接相關(guān)，因此，基于免疫方法控制、減少或根除具核梭桿菌在腸道的定植可有效預(yù)防結(jié)直腸癌的發(fā)生與發(fā)展。

細菌外膜囊泡(OMVs)是由細菌分泌產(chǎn)生的脂雙層近球形膜囊泡，大小為10～300nm，其組成成分包括外膜蛋白、脂多糖、周質(zhì)蛋白、內(nèi)膜蛋白、核酸及肽聚糖等。OMVs中的脂多糖、蛋白質(zhì)、毒力因子以及遺傳物質(zhì)等在細菌侵染過程中發(fā)揮了重要作用，包括促進發(fā)病、使細菌在應(yīng)激條件下存活、向臨近細胞傳遞遺傳物質(zhì)以及調(diào)節(jié)細菌群落相互作用等。由于細菌外膜囊泡自身的結(jié)構(gòu)與特性，使其在疫苗開發(fā)方面具備諸多潛力。一是其表面存在多種抗原，可降低病原體引發(fā)的，疫苗中靶抗原發(fā)生突變的可能性，進而降低疫苗產(chǎn)生逃逸變體的可能性；二是外膜囊泡具有內(nèi)在佐劑的能力，相較于傳統(tǒng)佐劑，外膜囊泡佐劑具有安全性高、能夠引起全面免疫等特點；三是外膜囊泡可作為粘膜轉(zhuǎn)運蛋白，將抗原轉(zhuǎn)運至粘膜屏障；四是外膜囊泡沒有生命力且不能復(fù)制，具有安全性。此外，外膜囊泡分離成本相對較低，可大大降低疫苗生產(chǎn)成本。因此，外膜囊泡已成為疫苗開發(fā)的熱門研究對象。例如，基于野生型腦膜炎奈瑟球菌外膜囊泡的疫苗已用于臨床，用于預(yù)防腦膜炎球菌病。

基于外膜囊泡的生物學(xué)功能，其臨床應(yīng)用前景可期。但有關(guān)具核梭桿菌外膜囊泡的相關(guān)研究較少，對于具核梭桿菌外膜囊泡在人結(jié)直腸癌的預(yù)防和治療方面的研究更是鮮有耳聞。并且目前對細菌外膜囊泡提取的方法多為超速離心法，這種方法分離得到的外膜囊泡數(shù)量較少，且含有鞭毛和細胞碎片等雜質(zhì)，導(dǎo)致提取的外膜囊泡質(zhì)量較差，細胞毒性較大。因此，建立一種能夠快速獲得大量低毒外膜囊泡的提取和純化技術(shù)是目前亟待解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容

為解決傳統(tǒng)結(jié)直腸癌化學(xué)預(yù)防的缺陷以及原有外膜囊泡提取方法產(chǎn)量低、毒性大、雜質(zhì)多的問題，本發(fā)明提供了一種具核梭桿菌外膜囊泡及其提取純化方法及應(yīng)用。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了如下方案：

本發(fā)明技術(shù)方案一：一種具核梭桿菌外膜囊泡的提取純化方法，包括以下步驟：

a.取具核梭桿菌菌種進行培養(yǎng)，獲得菌液；

b.取菌液第一次離心，過濾得上清液，濃縮濾液，將濃縮后的濾液第二次離心，去掉上清液，重懸沉淀后獲得粗提的外膜囊泡；

c.制作碘克沙醇密度梯度離心液，濃度由上至下依次增大，最上層加入粗提的外膜囊泡，進行密度梯度離心純化，即得純化后的外膜囊泡。

碘克沙醇密度梯度離心的原理是，利用緩沖液將碘克沙醇稀釋到不同濃度，不同濃度溶液具有不同密度。粗提液中含有多種組分，包括外膜囊泡、細菌細胞碎片、細菌鞭毛等，這些組分也具有不同的密度。離心過程中，在離心力的作用下，密度不同的顆粒將沉降到與其密度相等的離心液中，收集外膜囊泡聚集區(qū)域的離心液，去除離心液后，得到外膜囊泡。