[發明專利]一種表達大口黑鱸彈狀病毒G蛋白的重組酵母及其制備疫苗應用

在審

• 申請號: 202310311513.3
• 申請日: 2023-03-28
• 公開（公告）號: CN116410878A
• 公開（公告）日: 2023-07-11
• 發明（設計）人: 陳炯;魯建飛
• 申請（專利權）人: 寧波大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;C07K14/145;C12N15/47;A61K39/205;A61P31/14;C12R1/865
• 代理公司: 寧波奧圣專利代理有限公司 33226
• 代理人: 何仲

本發明公開了一種表達大口黑鱸彈狀病毒G蛋白的重組酵母及其制備疫苗應用，特點是重組酵母為轉化了pYD1?G重組質粒的釀酒酵母，命名為EBY100/pYD1?G，所述的pYD1?G重組質粒能在酵母表面展示系統表達MSRV?G蛋白，所述的MSRV?G蛋白的基因片段的核苷酸序列為SEQ?ID?NO.1所示，該重組酵母的制備方法包括以下步驟：(1)MSRV?G的克隆與擴增；(2)重組質粒pYD1?G的構建；(3)重組酵母EBY100/pYD1?G的分子構建，該重組酵母在制備大口黑鱸彈狀病毒疫苗中的應用，優點是高保護率且安全、有效、使用方便。

技術領域

本發明涉及水產動物疫苗領域，尤其是涉及一種表達大口黑鱸彈狀病毒G蛋白的重組酵母及其制備疫苗應用。

背景技術

大口黑鱸彈狀病毒(Micropterus?salmoides?rhabdovirus，MSRV)是引起大口黑鱸的主要病原，其致病性強、傳染性高，主要感染幼苗，發病后的魚群死亡率最高可達100％。MSRV屬于線性單股負鏈RNA病毒，病毒顆粒長300-500nm，直徑為100-200nm，由核酸、核衣殼和囊膜構成。病毒核酸編碼五種蛋白質，分別為：核蛋白(Nuclear?protein，N)，磷蛋白(Phosphoprotein，P)，基質蛋白(Matrixprotein，M)，糖蛋白(Glycoprotein，G)和病毒RNA依賴性RNA聚合酶(RNApolymerase，L)。G蛋白是嵌合在病毒粒子囊膜表面的唯一糖蛋白，含有與免疫相關的抗原決定簇，對MSRV血清學特征起決定性作用，是MSRV疫苗設計的主要靶標。

酵母表面展示技術是一種將異源蛋白展示于釀酒酵母細胞表面的真核表達系統。目的基因插入載體的Aga2基因下游，經過半乳糖誘導在酵母內大量表達目的蛋白-Aga2融合蛋白，在信號肽的作用下，該融合蛋白被運送至酵母細胞外。隨后，Aga2亞基通過二硫鍵與酵母表面的Aga1亞基相結合，將目的蛋白間接的錨定在酵母細胞表面，最終將目的蛋白展示于酵母表面。與細菌、噬菌體表面展示系統相比，酵母表面展示系統可降低生物安全風險，具有易于大量制備、本身為食品級而對魚沒有副作用、可作為免疫佐劑、展示表達的蛋白更易被識別結合等特點。

現有的適用于魚類免疫接種的方法主要有注射、口服、浸泡和后腸灌胃。注射免疫最常用的方式，具有注射計量精準、免疫效果強等特點，但易給魚體造成損傷并且對魚苗和較小的魚類不適用。口服和浸泡免疫與注射免疫相比，在使用過程中對魚體造成的機械損傷和刺激性均較小，不受魚大小限制，適用于群體免疫。目前，MSRV引起的疾病頻發，未有相關的疫苗上市，給養殖業造成了嚴重的經濟損失。因此研發安全高效的針對MSRV的疫苗，對促進大口黑鱸養殖業的健康發展有重要作用。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種表達大口黑鱸彈狀病毒G蛋白的重組酵母及其制備疫苗應用，該酵疫苗具有高保護率且安全、有效、使用方便。

本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為：一種表達大口黑鱸彈狀病毒G蛋白的重組酵母，所述的重組酵母為轉化了pYD1-G重組質粒的釀酒酵母，命名為EBY100/pYD1-G，所述的pYD1-G重組質粒能在酵母表面展示系統表達MSRV-G蛋白，所述的MSRV-G蛋白的基因片段的核苷酸序列為SEQ?ID?NO.1所示。

進一步，所述的釀酒酵母是Saccharomyces?cerevisiae?EBY100。

進一步，所述的pYD1-G重組質粒pYD1-G能融合表達MSRV-G蛋白基因片段與凝集素受體Aga2亞基；所述的Aga2亞基以C-末端與G蛋白融合，所述的酵母與凝集素受體Aga1亞基連接，所述的Aga1亞基與所述的pYD1-G重組質粒連接。

上述表達大口黑鱸彈狀病毒G蛋白的重組酵母的制備方法，包括以下步驟：

(1)MSRV-G的克隆與擴增；

(2)重組質粒pYD1-G的構建；