[發明專利]一種表達大口黑鱸彈狀病毒G蛋白的重組酵母及其制備疫苗應用

在審

• 申請號: 202310311513.3
• 申請日: 2023-03-28
• 公開（公告）號: CN116410878A
• 公開（公告）日: 2023-07-11
• 發明（設計）人: 陳炯;魯建飛
• 申請（專利權）人: 寧波大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;C07K14/145;C12N15/47;A61K39/205;A61P31/14;C12R1/865
• 代理公司: 寧波奧圣專利代理有限公司 33226
• 代理人: 何仲

1.一種表達大口黑鱸彈狀病毒G蛋白的重組酵母，其特征在于：所述的重組酵母為轉化了pYD1-G重組質粒的釀酒酵母，命名為EBY100/pYD1-G，所述的pYD1-G重組質粒能在酵母表面展示系統表達MSRV-G蛋白，所述的MSRV-G蛋白的基因片段的核苷酸序列為SEQ?ID?NO.1所示。

2.根據權利要求1所述的一種表達大口黑鱸彈狀病毒G蛋白的重組酵母，其特征在于：所述的釀酒酵母是Saccharomyces?cerevisiae?EBY100。

3.根據權利要求1所述的一種表達大口黑鱸彈狀病毒G蛋白的重組酵母，其特征在于：所述的pYD1-G重組質粒pYD1-G能融合表達MSRV-G蛋白基因片段與凝集素受體Aga2亞基；所述的Aga2亞基以C-末端與G蛋白融合，所述的酵母與凝集素受體Aga1亞基連接，所述的Aga1亞基與所述的pYD1-G重組質粒連接。

4.一種權利要求1所述的表達大口黑鱸彈狀病毒G蛋白的重組酵母的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)MSRV-G的克隆與擴增；

(2)重組質粒pYD1-G的構建；

(3)重組酵母EBY100/pYD1-G的分子構建。

5.根據權利要求4所述的一種表達大口黑鱸彈狀病毒G蛋白的重組酵母的制備方法，其特征在于步驟(1)具體為：根據MSRV-G蛋白的基因片段分別設計引物，引物F-1和R-1中的酶切位點分別是BamH?I和EcoR?I，引物序列如下：

F-1：5’-CGGGATCCCGATGCATCTCGCTGCGAAAGA-3’，R-1：5’-GAATTCGAATGCGGACAGCACGTCTGATTC-3’；利用特異性引物進行MSRV-G的擴增，擴增體系為：MSRV-G?cDNA?2.0μL、上游引物F-1?2.0μL、上游引物R-1?2.0μL、2×PrimeSTAR?Max?Premix25.0μL、ddH₂O?19.0μL，得到對PCR擴增產物進行純化回收，得到SRV-G蛋白片段。

6.根據權利要求4所述的一種表達大口黑鱸彈狀病毒G蛋白的重組酵母的制備方法，其特征在于步驟(2)具體為：

A.表達質粒pYD1的提取

利用質粒提取試劑盒從DH5α/pYD1提取質粒，-20℃保存，待用；

B.PCR產物及pYD1質粒雙酶切及膠回收

利用BamH?I、EcoR?I對純化的PCR產物與pYD1質粒進行雙酶切，反應體系如下：10×QuickCut?buffer?5μL，BamH?I?1μL，EcoR?I?1μL，DNA0.2μL，ddH₂O補足50μL，30℃酶切5min，37℃酶切5min；再通過瓊脂糖凝膠電泳檢測并純化，-20℃保存，待用；

C.MSRV-G與pYD1載體的連接與轉化

利用T4?DNALigase將酶切后的MSRV-G序列插入到pYD1載體中，連接體系如下：10×ligation?buffer?2μL、T4?DNALigase?1μL、pYD1載體DNA1μL、純化的PCR產物5μL、滅菌水11μL，總體系20μL，4℃連接過夜，得到重組質粒pYD1-G。

7.根據權利要求4所述的一種表達大口黑鱸彈狀病毒G蛋白的重組酵母的制備方法，其特征在于步驟(3)具體為：利用質粒提取試劑盒提取重組質粒pYD1-G；將重組質粒pYD1-G的電轉化至EBY100感受態細胞，經陽性克隆的篩選鑒定得到重組酵母EBY100/pYD1-G。

8.一種權利要求1所述的表達大口黑鱸彈狀病毒G蛋白的重組酵母在制備大口黑鱸彈狀病毒疫苗中的應用。