[發明專利]用于生產谷氨酸的大腸桿菌基因工程菌及構建方法與應用

在審

• 申請號: 202310301025.4
• 申請日: 2023-03-27
• 公開（公告）號: CN116426449A
• 公開（公告）日: 2023-07-14
• 發明（設計）人: 徐慶陽;王銳麒;陳志超
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/53;C12N15/60;C12N15/52;C12N15/70;C12N15/113;C12P13/18;C12R1/19
• 代理公司: 天津市三利專利商標代理有限公司 12107
• 代理人: 李蕊

本發明提供了一種用于生產谷氨酸的大腸桿菌基因工程菌及構建方法與應用，菌株通過代謝工程改造方法獲得，使用pbba?j23105啟動子強化Icd基因表達；使用trc啟動子強化谷氨酸棒桿菌來源的gdha基因過表達；使用pbba?j23110啟動子表達來源于青春雙歧桿菌的xfp基因；敲除了aceA、glnA基因，使用pbba?j23117啟動子替換了sucA、sucB基因原有啟動子，弱化該基因表達；菌株具有較好的穩定性，通過發酵方法生產獲得谷氨酸，對發酵營養要求較低，發酵條件溫和、產品分離提取簡單、發酵周期短的優點，為谷氨酸工業化提供新思路，具有實際應用價值。

技術領域

本發明涉及生物技術生產領域，尤其是一種用于生產谷氨酸的大腸桿菌基因工程菌及構建方法與應用。

背景技術

谷氨酸是一種構成蛋白質的α-氨基酸，大量存在于谷類蛋白質及動物腦中，在生物體代謝過程中發揮著重要作用。谷氨酸用途廣泛，在食品行業中，谷氨酸與堿作用可以生成谷氨酸鈉，俗稱味精，是重要的調味品；在醫藥行業中，人體吸收的谷氨酸容易在體內形成谷氨酰胺，提高大腦的機能；在日用化妝品行業中，谷氨酸經過脫羧處理生成N-?；劝彼徕c，可添加于香皂、洗潔精等日用品，具有很強的發泡和洗滌能力；在農產品行業中，谷氨酸銅可以用作產品殺菌劑，可以防止農作物腐敗。谷氨酸已成為了世界上最大的氨基酸產品，年產量接近300萬噸，產值超過400億，市場前景廣闊，潛力巨大。

目前，谷氨酸的生產菌種為谷氨酸棒狀桿菌，國內現有谷氨酸生產菌株主要類型為溫度敏感型和生物素亞適量型，傳統溫度敏感型菌株發酵谷氨酸時，玉米漿用量高，發酵易起泡，發酵后期易染菌，提取過程谷氨酸發酵液濃縮比低；傳統生物素亞適量型菌株發酵谷氨酸時，需要嚴格控制生物素的含量，傳統發酵生物素主要來源為玉米漿，不同批次玉米漿生物素含量不一，對發酵造成很大影響，產物收率低，工序多，產酸不穩定。

綜上所述，傳統的谷氨酸棒狀桿菌對市場上谷氨酸工業化要求嚴格，且分子學改造復雜不穩定，因此急需一種高效、方便、安全、穩定的工程菌株。而大腸桿菌培養方便、操作簡單、成本低廉、基礎生物學、分子遺傳學等方面的背景知識清晰，對其基因表達調控的分子機理也比較清楚，而且經歷二十年的基因工程實踐，大腸桿菌已經發展為一種安全的基因工程實驗體系，有多種適用的寄主菌株和載體體系，大腸桿菌易于進行工業化批量生產。發酵工藝要求較谷氨酸棒狀桿菌低，成為替代目前生產菌株的首選。

發明內容

本發明所要解決的技術問題在于提供一種用于生產谷氨酸的大腸桿菌基因工程菌。

本發明所要解決的技術問題在于提供上述用于生產谷氨酸的大腸桿菌基因工程菌的構建方法。

本發明所要解決的技術問題在于提供上述大腸桿菌基因工程菌的應用。

為解決上述技術問題，本發明的技術方案是：

一種用于生產谷氨酸的大腸桿菌基因工程菌，是利用代謝工程改造野生型E.coliMG1655得到的：敲除aceA基因，并在該位點整合了使用P_j23105啟動子控制表達的Icd基因；和/或敲除了glnA基因，并在該位點整合了使用P_trc啟動子控制表達的gdha基因；和/或敲除了rph假基因位點，并在該位點整合了使用P_j23110啟動子控制表達的xfp基因；和/或敲除了sucA、sucB基因原有的啟動子，使用P_j23117啟動子控制sucA、sucB基因共同表達。

即上述用于生產谷氨酸的大腸桿菌基因工程菌，是在出發菌株野生型E.coliMG1655基礎上進行進一步改造獲得的，具體為：

在aceA基因位點使用P_j23105啟動子控制Icd基因過表達得到菌株Glu01；

以菌株Glu01為出發菌株，在glnA基因位點使用P_trc啟動子控制gdhA基因過表達，得到菌株Glu02；