[發(fā)明專利]一種鑒定耐草劑玉米的引物組、試劑盒及其方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202310299639.3
• 申請日: 2023-03-20
• 公開（公告）號: CN116219065A
• 公開（公告）日: 2023-06-06
• 發(fā)明（設計）人: 何軍光;周駿;樓億圓;苗昱婷;李焰;任鑫;李靜靜;張凌燕;任志勇;顧偉航;陸建明
• 申請（專利權）人: 浙江新安化工集團股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6869;C12N15/00
• 代理公司: 北京秉文同創(chuàng)知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙) 11859
• 代理人: 陳少麗;孫富利

1.一種鑒定耐草劑玉米的引物組，其特征在于，所述引物組包括：第一引物對和第二引物對中的至少一對，所述第一引物對包括第一引物和第二引物，所述第一引物的序列如序列表中SEQ?ID?NO：1所示，所述第二引物的序列如序列表中SEQ?ID?NO：2所示，所述第二引物對包括第三引物和第四引物，所述第三引物的序列如序列表中SEQ?ID?NO：3所示，所述第四引物的序列如序列表中SEQ?ID?NO：4所示。

2.一種鑒定耐草劑玉米的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括：如權利要求1所述的引物組，所述試劑盒還包括：DNA聚合酶和dNTP。

3.根據(jù)權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述第一引物、所述第二引物、所述第三引物、所述第四引物的終濃度均為0.25μM。

4.一種鑒定耐草劑玉米的方法，其特征在于，所述方法包括：

獲得待測玉米的基因組DNA；

將所述基因組DNA進行酶切，得到酶切片段；

將所述酶切片段進行環(huán)化，得到環(huán)化基因組DNA；

以所述環(huán)化基因組DNA為模板，采用反向PCR引物組進行2輪PCR擴增，得到反向PCR擴增產(chǎn)物；

將所述反向PCR產(chǎn)物進行測序，并與參考基因組進行比對，確定外源插入序列的插入位點，確定外源插入序列兩側的旁側序列；

以所述基因組DNA為模板，采用測序引物進行擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物，將產(chǎn)物測序，驗證所述產(chǎn)物序列是否與所述旁側序列和所述外源插入序列一致；

若所述產(chǎn)物序列與所述旁側序列和所述外源插入序列一致，則根據(jù)所述旁側序列，以所述基因組DNA為模板，采用如權利要求1所述的引物組進行擴增，得到PCR產(chǎn)物，將所述PCR產(chǎn)物與所述預期的DNA片段進行比對，若所述PCR產(chǎn)物與所述預期的DNA片段一致，則鑒定為耐草劑玉米WYN17132。

5.根據(jù)權利要求4所述的方法，其特征在于，確定所述預期的DNA片段的方法包括：若所述引物組為第一引物和所述第二引物，則所述預期的DNA片段為275bp的DNA片段。

6.根據(jù)權利要求4所述的方法，其特征在于，若所述引物組為所述第三引物和所述第四引物，則所述預期的DNA片段為bp的DNA片段。

7.根據(jù)權利要求4所述的方法，其特征在于，所述PCR擴增的程序包括35個循環(huán)，每個循環(huán)均包括：95℃5min，95℃30s，58℃30s，72℃45s，循環(huán)結束；然后72℃5min；最后保持在4℃。

8.根據(jù)權利要求4所述的方法，其特征在于，所述第一引物、所述第二引物、所述第三引物和所述第四引物的終濃度均為0.25μM。