[發明專利]一種純化HER2單鏈抗體的方法

在審

• 申請號: 202310298970.3
• 申請日: 2023-03-24
• 公開（公告）號: CN116284410A
• 公開（公告）日: 2023-06-23
• 發明（設計）人: 周妍婷;張雷;李杉
• 申請（專利權）人: 華南理工大學
• 主分類號: C07K16/32
• 分類號: C07K16/32;C12N15/70
• 代理公司: 廣州廣典知識產權代理事務所(普通合伙) 44365
• 代理人: 萬志香

本發明公開了一種純化HER2單鏈抗體(scFv)的方法，所述方法通過SPY?Cather蛋白與SPY?Tag多肽間的特異性結合，經過PT?Linker?SPY?Cather重組蛋白修飾的環氧載體，用以捕獲scFv?Mxe?GyrA?EGFP?SPY?Tag重組蛋白，并通過單因素試驗與響應面法優化出最優的反應條件提高了該載體的吸附效率，最后利用二硫蘇糖醇(DTT)使Mxe?GyrA內含肽發生N端斷裂，一步法釋放出單鏈抗體(scFv)，所述HER2單鏈抗體保持活性不變。本發明簡化單鏈抗體純化的操作流程、一步洗脫與標簽切除、提供了一種無蛋白液相純化儀與純化柱也可純化蛋白的方法，不僅適用于單鏈抗體的純化、也適用于其他多種蛋白質的純化，具有廣闊的應用前景。

技術領域

本發明屬于蛋白表達技術領域，具體涉及一種快速的純化HER2單鏈抗體(HER2-scfv)的方法。

背景技術

乳腺癌目前已成為女性診斷和死亡率高的惡性腫瘤。其中大約25-30％的乳腺癌患者存在人類表皮生長因子受體(HER2)過度表達，近年來隨著靶向治療的發展，針對HER2為治療靶點的抗體偶聯藥物已成為當下的研究熱點。

單鏈抗體(scFv)相對分子質量小，更容易穿透組織到達靶部位，使腫瘤周圍達到有效的血藥濃度；由于缺少Fc段，scFv并不具備完整抗體的效應功能從而導致免疫原性降低，不易引起人體排斥和超敏反應；scFv在體內清除速度快，減少了全抗分子帶來的心臟、肝、腎等重要器官的損傷。因此，scFv逐漸成為了基因工程抗體的研究熱點之一。

蛋白質內含肽(intein)是前體未成熟蛋白質中的一段多肽鏈，可通過蛋白質自我剪接作用實現蛋白質結構的重新排列。Mxe?GryA是蟾分枝桿菌Mycobacterium?xenopiGryA中198Aa組成的微小型內含肽，將其C端剪接結構模塊中的天冬氨酸突變為丙氨酸后可阻斷內含肽C端的剪接反應，但在其N末端半胱氨酸處仍然可發生N-S酰基重排形成硫酯鍵，可通過添加硫醇試劑如二硫蘇糖醇(DTT)來控制硫酯鍵的斷裂。

SPY?Cather與SPY?Tag是來自化膿性鏈球菌(Streptococcus?pyogenes)的纖連結合蛋白(FbaB)第二個免疫球樣膠原黏附蛋白結構域(CnaB2)的兩個可通過異肽鍵結合的蛋白。SPY?Cather與SPY?Tag可以在各種不同的條件下(pH、溫度、緩沖液組分)可迅速形成穩固的異肽鍵且不容易發生斷裂。

單鏈抗體因與質粒、標簽構建簡便且在重組質粒可在大腸桿菌中成功表達，有利于發揮其免疫診斷、治療作用。大腸桿菌作為傳統生物學表達系統之一，易于培養、遺傳背景清晰是表達外原蛋白的首選表達系統。但目前單鏈抗體在表達純化方面仍然存在上清表達量較低、沉淀表達操作復雜、純化步驟繁瑣等問題。實現單鏈抗體的可溶性表達、簡化蛋白純化過程，對后續單鏈抗體的研究及治療具有重要意義。

發明內容

本發明的目的在于提供了一種一步法純化單鏈抗體的方式，所述方法通過SPYCather與SPY?Tag之間的特異性捕獲scFv，再利用二硫蘇糖醇(DTT)使Mxe?GyrA內含肽發生N端斷裂純化scFv，從而實現無需儀器與純化柱的一步分離純化單鏈抗體的新方法。

本發明的目的可通過以下技術實現。

本發明的的第一個方面，提供了一種用于修飾環氧載體的PT?Linker-SPY?Cather重組蛋白，所述重組蛋白由多肽片段PT?Linker和SPY?Cather蛋白組成，所述PT?Linker-SPY?Cather重組蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。

本發明的的第二個方面，提供了一種scFv-Mxe?GyrA-SPY?Tag重組蛋白，所述重組蛋白由單鏈抗體(scFv)、內含肽(Mxe?GyrA)及多肽片段SPY?Tag組成，所述scFv-Mxe?GyrA-EGFP-SPY?Tag重組蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.4所示。