[發明專利]一種純化HER2單鏈抗體的方法

在審

• 申請號: 202310298970.3
• 申請日: 2023-03-24
• 公開（公告）號: CN116284410A
• 公開（公告）日: 2023-06-23
• 發明（設計）人: 周妍婷;張雷;李杉
• 申請（專利權）人: 華南理工大學
• 主分類號: C07K16/32
• 分類號: C07K16/32;C12N15/70
• 代理公司: 廣州廣典知識產權代理事務所(普通合伙) 44365
• 代理人: 萬志香

1.一種用于修飾環氧載體的PT?Linker-SPY?Cather重組蛋白，其特在在于，所述PTLinker-SPY?Cather重組蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。

2.一種scFv-Mxe?GyrA-SPY?Tag重組蛋白，其特在在于，所述scFv-Mxe?GyrA-EGFP-SPYTag重組蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.4所示。

3.一種純化HER2單鏈抗體的方法，其特在在于，包括如下步驟：

1)將PT?Linker-SPY?Cather基因序列插入到表達載體的多克隆位點構建重組表達質粒，并在大腸桿菌中成功表達PT?Linker-SPY?Cather重組蛋白，純化得到PT?Linker-SPYCather重組蛋白，將PT?Linker-SPY?Cather重組蛋白與環氧載體LX-1000EP在室溫下孵育，得到PT?Linker-SPY?Cather-LX1000EP環氧載體；

2)將scFv-Mxe?GyrA-EGFP-SPY?Tag重組蛋白的融合基因核苷酸編碼序列插入到表達載體的多克隆位點構建重組表達質粒，并在大腸桿菌中表達，獲得細胞裂解上清中的scFv-Mxe?GyrA-EGFP-SPY?Tag重組蛋白；

3)將步驟(1)中得到的PT?Linker-SPY?Cather-LX1000EP環氧載體吸附步驟2)獲得細胞裂解上清中的scFv-Mxe?GyrA-EGFP-SPY?Tag重組蛋白；

4)除去未吸附的雜蛋白，加入DTT的磷酸鹽緩沖液將被吸附的scFv洗脫下來。

4.根據權利要求3所述純化單鏈抗體的方法，其特在在于，步驟3)中的吸附反應條件為：反應體積為0.2mL-0.4mL，反應pH為8.0-9.0，反應溫度為25℃-30℃。

5.根據權利要求3所述純化單鏈抗體的方法，其特在在于，每50mg所述PT?Linker-SPYCather-LX1000EP環氧載體，加入0.3mL-0.4mL?pET28b-scFv-Mxe?GyrA-EGFP-SPY?Tag大腸桿菌裂解上清液中。

6.根據權利要求4所述純化單鏈抗體的方法，其特在在于，步驟3)中的吸附反應條件為：在26℃條件下25rpm攪拌反應2h，反應pH為8.4。

7.根據權利要求3-6任一項所述純化單鏈抗體的方法，其特在在于，所述scFv-MxeGyrA-EGFP-SPY?Tag重組蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達，包括步驟如下：

2.1)scFv-Mxe?GyrA-EGFP-SPY?Tag重組質粒的構建：

利用RF克隆方法將scFv和EGFP基因核苷酸編碼序列與pET28a-EGFP-SPY?Tag表達載體連接，

2.2)將培養過夜的菌液接種于LB液體培養基中擴大培養，當OD₆₀₀為1.0時加至終濃度為0.3mM-0.8mM的異丙醇-β-硫代半乳糖苷，16±1℃誘導12±1h后收集菌體。

8.根據權利要求7所述純化單鏈抗體的方法，其特在在于，構建pET28b-scFv-MxeGyrA-EGFP-SPY?Tag重組蛋白表達時的引物如SEQ?ID?NO.5-SEQ?ID?NO.8所示。

9.根據權利要求3-6任一項所述純化單鏈抗體的方法，其特在在于，步驟4)中加入15-25mM?DTT的磷酸鹽緩沖液。

10.根據權利要求3-6任一項所述純化單鏈抗體的方法，其特在在于，步驟1)中的表達載體為pET30a，步驟2)中的表達載體為pET28b(+)。