[發明專利]一種重組L-氨基酸脫氨酶大腸桿菌基因工程菌及其構建方法和應用

在審

• 申請號: 202310298716.3
• 申請日: 2023-03-24
• 公開（公告）號: CN116376794A
• 公開（公告）日: 2023-07-04
• 發明（設計）人: 張洪斌;常俊璋;楊靜文;邵子龍
• 申請（專利權）人: 合肥工業大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/55;C12N15/70;C12P7/40;C12R1/19
• 代理公司: 合肥云道爾知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 34230
• 代理人: 常雅雅

本發明公開了一種重組L?氨基酸脫氨酶大腸桿菌基因工程菌及其構建方法和應用，所述工程菌以來源于Proteusmirabilis的氨基酸脫氨酶基因為模板，將該酶命名為PM473，以pET?20b為載體，重組轉化到BL21(DE3)大腸桿菌中獲得適合氨基酸脫氨功能的E.coli?BL21(DE3)/pET20b?PM473基因工程菌，使用驗證過的基因工程菌生產L?氨基酸脫氨酶大腸桿菌全細胞催化劑，可以催化谷氨酰胺生產α?酮戊二胺酸并實現對混旋體的手性拆分，催化產物只有α?酮戊二胺酸和副產物NHsubgt;3/subgt;，以及剩余未反應的D?谷氨酰胺，分離純化簡單。對反應時間加以控制，混旋底物中的L?谷氨酰胺轉化率為100％，D?谷氨酰胺轉化率為58.5％。該酶還可以催化L?丙氨酸，L?蘇氨酸，苯丙氨酸，半胱氨酸生產相應的α?酮酸。

技術領域

本發明涉及一種餐飲業廢水處理裝置，具體涉及一種重組L-氨基酸脫氨酶大腸桿菌基因工程菌及其構建方法和應用。

背景技術

α-酮酸是一種重要的精細化工中間體，在醫藥、食品添加劑、食品、化妝品等化學合成領域有著廣泛的應用。現階段市場上大部分的酮酸都是通過化學合成的方法制備的，這樣生產不僅不環保，而且還會產生各種有毒的副產品。隨著生物工程技術的發展，酮酸的生物合成已被發現，并在微生物中應用不同的代謝工程策略以可再生碳水化合物生產特定的酮酸。

α-酮戊二胺酸(α-ketoglutaramic?acid)，又叫做α-酮谷氨酸(α-ketoglutaramate)，2-氧戊二胺酸(2-oxoglutaramate)，2-羥基-5-氧脯氨酸(2-hydroxy-5-oxoproline)，在植物體內通過轉氨酶和水解酶的連續作用下進行合成和代謝；在動物肝臟和腎臟中也發現了類似的轉氨酶、水解酶以及α-酮戊二胺酸。α-酮戊二胺酸作為植物生長調節劑在農業上具有廣泛的用途；在生物學研究中，人類ω-酰胺酶(腈水解酶，Nitrilase?2)已被確定為一種公認的腫瘤抑制蛋白，可將癌細胞抑制在G2細胞周期階段，Nitrilase?2信息在研究過的每一個人體組織(心臟、大腦、胎盤、肺、肝臟、骨骼肌、腎臟、胰腺、脾臟、胸腺、前列腺、睪丸、卵巢、小腸、結腸和白細胞)中都有表達，在肝臟和腎臟中表達最高，而α-酮戊二胺酸作為Nitrilase2的底物，是研究該酶的規范作用和該酶在多種疾病中的作用所必需的。目前生產α-酮戊二胺酸最容易利用的制備方法是以蛇毒衍生的L-氨基酸氧化酶氧化L-谷氨酰胺，這不僅成本昂貴，而且在生產過程中會產生有害的H₂O₂。

發明內容

本發明的目的在于提供一種重組L-氨基酸脫氨酶大腸桿菌基因工程菌及其構建方法和應用，其可以解決上述背景技術提出的技術問題。

在本發明的一個方面，本發明提出了一種重組L-氨基酸脫氨酶大腸桿菌基因工程菌。根據本發明的實施例，以來源于Proteus?mirabilis的L-氨基酸脫氨酶基因為模板，將該酶命名為PM473，以pET-20b為載體，以SalI-XhoI為克隆位點，重組轉化到大腸桿菌感受態細胞BL21(DE3)中獲得重組L-氨基酸脫氨酶大腸桿菌E.coli?BL21(DE3)/pET20b-PM473基因工程菌。

在本發明的另一方面，本發明提出了一種重組L-氨基酸脫氨酶大腸桿菌基因工程菌的構建方法。根據本發明的實施例，以來源于Proteus?mirabilis的L-氨基酸脫氨酶基因GeneBank:MG746627.1為模板，將該酶命名為PM473，以SalI-XhoI為克隆位點將PM473插入到pET-20b載體中，通過PCR擴增技術，得到重組表達質粒pET20b-PM473，將重組表達質粒pET20b-PM473轉化到大腸桿菌感受態細胞BL21(DE3)中，經過氨芐青霉素抗性篩選、酶切、菌液PCR和SDS-PAGE驗證后獲得重組L-氨基酸脫氨酶大腸桿菌E.coli?BL21(DE3)/pET20b-PM473基因工程菌。