[發明專利]一種重組L-氨基酸脫氨酶大腸桿菌基因工程菌及其構建方法和應用

在審

• 申請號: 202310298716.3
• 申請日: 2023-03-24
• 公開（公告）號: CN116376794A
• 公開（公告）日: 2023-07-04
• 發明（設計）人: 張洪斌;常俊璋;楊靜文;邵子龍
• 申請（專利權）人: 合肥工業大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/55;C12N15/70;C12P7/40;C12R1/19
• 代理公司: 合肥云道爾知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 34230
• 代理人: 常雅雅

1.一種重組L-氨基酸脫氨酶大腸桿菌基因工程菌，其特征在于：以來源于Proteusmirabilis的L-氨基酸脫氨酶基因為模板，將該酶命名為PM473，以pET-20b為載體，重組轉化到大腸桿菌感受態細胞BL21(DE3)中獲得重組L-氨基酸脫氨酶大腸桿菌E.coliBL21(DE3)/pET20b-PM473基因工程菌。

2.一種重組L-氨基酸脫氨酶大腸桿菌基因工程菌的構建方法，其特征在于：以來源于Proteusmirabilis的L-氨基酸脫氨酶基因GeneBank:MG746627.1為模板，將該酶命名為PM473，以SalI-XhoI為克隆位點將PM473插入到pET-20b載體中，通過PCR擴增技術，得到重組表達質粒pET20b-PM473，將重組表達質粒pET20b-PM473轉化到大腸桿菌感受態細胞BL21(DE3)中，經過氨芐青霉素抗性篩選、酶切、菌液PCR和SDS-PAGE驗證后獲得重組L-氨基酸脫氨酶大腸桿菌E.coliBL21(DE3)/pET20b-PM473基因工程菌。

3.一種L-氨基酸脫氨酶大腸桿菌全細胞催化劑，其特征在于：所述全細胞催化劑為權利要求1所述的重組L-氨基酸脫氨酶大腸桿菌基因工程菌的全細胞菌體。

4.一種L-氨基酸脫氨酶大腸桿菌全細胞催化劑的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：將權利要求1所述的重組L-氨基酸脫氨酶大腸桿菌基因工程菌接種到含有氨芐青霉素的LB培養基中，培養得到種子液，將種子液中加入到含有氨芐青霉素抗性的TB培養基中進行培養、誘導產酶，將誘導發酵后的菌懸液離心，使用Na₂HPO₄-NaH₂PO₄緩沖液振蕩清洗，再次離心后得到L-氨基酸脫氨酶大腸桿菌全細胞菌體，即為L-氨基酸脫氨酶大腸桿菌全細胞催化劑，將所述全細胞菌體保存于上述Na₂HPO₄-NaH₂PO₄緩沖液中。

5.根據權利要求4所述的一種L-氨基酸脫氨酶大腸桿菌全細胞催化劑的制備方法，其特征在于：

所述基因工程菌按體積分數0.5％～1％的接種量接種到含有100～200μg/ml氨芐青霉素的LB培養基中，轉速200～250r/min，在30～40℃下培養10～14小時；

所述種子液按體積分數0.5％～1％接種量接種到含有100～200μg/ml氨芐青霉素的TB培養基中，放置于30～40℃下搖床培養；

當加入新的TB培養基中富集培養的菌液OD₆₀₀在1.6～2.0時，加入0.05～0.5mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷，15～25℃范圍內誘導發酵10～14小時；

所述離心的溫度為4～30℃，轉速為8000～10000r/min，時間為10～15min；

所述Na₂HPO₄-NaH₂PO₄緩沖液的pH為6.0～8.0，濃度為0.01～0.05mol/L。

6.一種α-酮酸的制備方法，其特征在于：以氨基酸為底物，利用權利要求3所述的L-氨基酸脫氨酶大腸桿菌全細胞催化劑進行催化脫氨生成相應的α-酮酸。

7.根據權利要求6所述的一種α-酮酸的制備方法，其特征在于：所述氨基酸為混旋谷氨酰胺、L-丙氨酸、L-蘇氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸中的一種，分別得到α-酮戊二胺酸、丙酮酸、2-酮基3-羥基丁酸、苯丙酮酸、2-酮基-3-巰基丙酸。

8.根據權利要求6所述的一種α-酮酸的制備方法，其特征在于，具體包括以下步驟：以氨基酸為底物，利用Na₂HPO₄-NaH₂PO₄緩沖液溶解底物，加入L-氨基酸脫氨酶大腸桿菌全細胞催化劑進行反應，取出反應液后使酶失活，然后離心，離心后保留上清反應液棄去沉淀，所述上清反應液即為α-酮戊二胺酸。