[發(fā)明專利]PE-Nt4引導(dǎo)編輯系統(tǒng)及其在基因組堿基編輯中的應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202310298314.3
• 申請(qǐng)日: 2023-03-24
• 公開（公告）號(hào): CN116478987A
• 公開（公告）日: 2023-07-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊進(jìn)孝;徐雯;楊永星;李璐;張成偉;張璐
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京市農(nóng)林科學(xué)院;北京農(nóng)科院種業(yè)科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/113
• 分類號(hào): C12N15/113;C12N9/12;C12N9/22;C07K19/00;C12N15/84;A01H5/00;A01H6/82
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 李洋

本發(fā)明公開了PE?Nt4引導(dǎo)編輯系統(tǒng)及其在基因組堿基編輯中的應(yīng)用。所述PE?Nt4引導(dǎo)編輯系統(tǒng)包括nesgRNA、pegRNA、融合蛋白和紫色篩選標(biāo)記蛋白PAP1，其中，融合蛋白依次包括M?MLV?RT、Cas9n(H840A)、P2A和潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶。通過實(shí)驗(yàn)證明：與PE?Nt2和PE?Nt3相比，PE?Nt4引導(dǎo)編輯系統(tǒng)對(duì)煙草靶點(diǎn)的編輯效率顯著提高。同時(shí)，PAP1基因表達(dá)會(huì)導(dǎo)致花青素的合成，形成肉眼可辨的紫色，不僅可用于陽(yáng)性T0苗的直接篩選，還可用于直接剔除含有轉(zhuǎn)基因標(biāo)簽的T1苗。更為重要的是，本發(fā)明利用PE?Nt4系統(tǒng)在雙子葉植物中實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)堿基突變的穩(wěn)定遺傳。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及PE-Nt4引導(dǎo)編輯系統(tǒng)及其在基因組堿基編輯中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

CRISPR-Cas9技術(shù)已經(jīng)成為強(qiáng)有力的基因組編輯手段，被廣泛應(yīng)用到很多組織和細(xì)胞中。CRISPR/Cas9?protein-RNA復(fù)合物通過向?qū)NA(guide?RNA)定位于靶點(diǎn)上，切割產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂(dsDNA?break，DSB)，而后生物體會(huì)本能的啟動(dòng)DNA修復(fù)機(jī)制修復(fù)DSB。修復(fù)機(jī)制一般有兩種，一種是非同源末端連接(non-homologous?end?joining，NHEJ)，另一種是同源重組(homology-directed?repair，HDR)。通常情況下NHEJ占大多數(shù)，因此修復(fù)產(chǎn)生的隨機(jī)的indels(insertions?or?deletions)比精確修復(fù)高很多。對(duì)于堿基精確替換，因?yàn)镠DR效率低以及需要DNA模板，所以使用HDR實(shí)現(xiàn)堿基精確替換的應(yīng)用受到很大的限制。2016年和2017年相繼報(bào)道的胞嘧啶堿基編輯器和腺嘌呤堿基編輯器雖可以精確的實(shí)現(xiàn)胞嘧啶(Cytosine，C)到胸腺嘧啶(Thymine，T)以及腺嘌呤(Adenine，A)到鳥嘌呤(Guanine，G)的轉(zhuǎn)換，且不產(chǎn)生DSB也不引入DNA模板，但無(wú)法實(shí)現(xiàn)嘌呤和嘧啶之間的顛換，即無(wú)法實(shí)現(xiàn)A到T的替換、T到A的替換、C到G的替換、G到C的替換、A到C的替換、T到G的替換、C到A的替換、G到T的替換。同時(shí)，堿基編輯器只能編輯活性窗口內(nèi)的C或T，而且當(dāng)活性窗口內(nèi)存在多個(gè)C或多個(gè)T時(shí)，容易產(chǎn)生靶標(biāo)C或T與非靶標(biāo)C或T共編輯而不能最終得到預(yù)期編輯產(chǎn)物。所有這些弊端大大限制了堿基編輯器的實(shí)際應(yīng)用。

2019年，David?Liu實(shí)驗(yàn)室報(bào)道了一種新的基因組編輯技術(shù)，即引導(dǎo)編輯技術(shù)(Prime?editing)，開發(fā)了三種引導(dǎo)編輯器(Prime?editor，PE)，分別是PE1、PE2和PE3。所有這三種PE均為反轉(zhuǎn)錄酶(reverse?transcriptase，RT)與Cas9?H840A切口酶(Cas9n(H840A))融合在一起，使用引導(dǎo)編輯技術(shù)向?qū)NA(prime?editing?guide?RNA，pegRNA)實(shí)現(xiàn)基因組編輯。pegRNA除了包含通常的向?qū)NA(sgRNA)外，還包含一段含有目標(biāo)堿基突變的RT模板以及引物結(jié)合位點(diǎn)(primer?binding?site，PBS)。實(shí)驗(yàn)表明該技術(shù)可在動(dòng)物細(xì)胞基因組中實(shí)現(xiàn)所有12種堿基替換類型的編輯，打破了傳統(tǒng)堿基編輯器的限制，大大提高了堿基編輯范圍。此后，PE系統(tǒng)在一些單子葉植物中被迅速開發(fā)和應(yīng)用，如水稻、小麥和玉米，但PE系統(tǒng)在雙子葉植物中的報(bào)道十分有限，包括擬南芥、煙草、花生、鷹嘴豆和豇豆等，且PE系統(tǒng)測(cè)試大多局限在瞬時(shí)轉(zhuǎn)化水平。目前，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化水平尚無(wú)產(chǎn)生可穩(wěn)定遺傳的PE系統(tǒng)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種成套系統(tǒng)。

本發(fā)明提供的成套系統(tǒng)包括pegRNA、融合蛋白和顏色篩選標(biāo)記蛋白；

所述pegRNA依次包括esgRNA、逆轉(zhuǎn)錄模板序列(RT序列)和引物結(jié)合位點(diǎn)序列(PBS序列)；

所述融合蛋白依次包括反轉(zhuǎn)錄酶、Cas9切刻酶、自切割寡肽和篩選劑抗性蛋白。

上述成套系統(tǒng)中，所述pegRNA中的esgRNA依次由靶點(diǎn)序列(記作靶點(diǎn)序列甲)和esgRNA骨架組成。所述esgRNA骨架為將表2中序列1第762-847位中的T替換為U后得到的RNA分子。