[發明專利]PE-Nt4引導編輯系統及其在基因組堿基編輯中的應用

在審

• 申請號: 202310298314.3
• 申請日: 2023-03-24
• 公開（公告）號: CN116478987A
• 公開（公告）日: 2023-07-25
• 發明（設計）人: 楊進孝;徐雯;楊永星;李璐;張成偉;張璐
• 申請（專利權）人: 北京市農林科學院;北京農科院種業科技有限公司
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N9/12;C12N9/22;C07K19/00;C12N15/84;A01H5/00;A01H6/82
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 李洋

1.成套系統，所述成套系統包括pegRNA、融合蛋白和顏色篩選標記蛋白；

所述pegRNA依次包括esgRNA、逆轉錄模板序列和引物結合位點序列；

所述融合蛋白依次包括反轉錄酶、Cas9切刻酶、自切割寡肽和篩選劑抗性蛋白。

2.根據權利要求1所述的成套系統，其特征在于：所述Cas9切刻酶為Cas9n(H840A)；

和/或，所述Cas9n(H840A)為A1)或A2)：

A1)氨基酸序列是序列表中序列1所示的蛋白質；

A2)將序列表中序列1所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白質。

3.根據權利要求1或2所述的成套系統，其特征在于：所述反轉錄酶為M-MLV?RT；

或，所述M-MLV?RT為B1)或B2)：

B1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白質；

B2)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白質。

4.根據權利要求1-3任一所述的成套系統，其特征在于：所述自切割寡肽為來源于病毒基因組的2A自切割寡肽；

或，所述來源于病毒基因組的2A自切割寡肽為來源于豬捷申病毒-1的2A自切割寡肽；

或，所述來源于豬捷申病毒-1的2A自切割寡肽的氨基酸序列為C1)或C2)：

C1)氨基酸序列是序列表中序列3所示的多肽；

C2)將序列表中序列3所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的多肽。

5.根據權利要求1-4任一所述的成套系統，其特征在于：所述篩選劑抗性蛋白為潮霉素磷酸轉移酶和/或卡那霉素抗性蛋白；

或，所述潮霉素磷酸轉移酶為D1)或D2)：

D1)氨基酸序列是序列表中序列4所示的蛋白質；

D2)將序列表中序列4所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白質；

或，所述卡那霉素抗性蛋白為E1)或E2)：

E1)氨基酸序列是序列表中序列5所示的蛋白質；

E2)將序列表中序列5所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白質。

6.根據權利要求1-5任一所述的成套系統，其特征在于：所述顏色篩選標記蛋白為PAP1蛋白；

或，所述PAP1蛋白為F1)或F2)：

F1)氨基酸序列是序列表中序列6所示的蛋白質；

F2)將序列表中序列6所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白質。

7.權利要求1-6任一所述的成套系統在如下S1)-S5)任一種中的應用：

S1)植物或植物細胞基因組序列的編輯；

S2)制備植物或植物細胞基因組序列的編輯的產品；

S3)提高植物或植物細胞基因組序列的編輯效率；

S4)制備提高植物或植物細胞基因組序列的編輯效率的產品；

S5)制備穩定遺傳的植物突變體。

8.T1)-T3)任一所述的方法：

T1)基因組序列的編輯方法，包括如下步驟：使植物或植物細胞表達權利要求1中所述的融合蛋白、權利要求1中所述的pegRNA和權利要求1中所述的顏色篩選標記蛋白；

T2)提高植物或植物細胞基因組序列的編輯效率的方法，包括如下步驟：使植物或植物細胞表達權利要求1中所述的融合蛋白、權利要求1中所述的pegRNA和權利要求1中所述的顏色篩選標記蛋白；

T3)穩定遺傳的植物突變體的制備方法，包括如下步驟：按照T1)或T2)所述的方法對植物基因組序列進行編輯，獲得穩定遺傳的植物突變體。