[發明專利]一種谷氨酸脫羧酶及其基因和應用

有效

• 申請號: 202310289400.8
• 申請日: 2023-03-23
• 公開（公告）號: CN116478974B
• 公開（公告）日: 2023-10-13
• 發明（設計）人: 王東陽;孔建彪;戈連峰;呂常江;陳正
• 申請（專利權）人: 山東陽成生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88;C12N15/60;C12N15/70;C12N15/74;C12N1/21;C12P13/00;C12R1/19;C12R1/01
• 代理公司: 濟南果盾專利代理事務所(普通合伙) 37390
• 代理人: 馬瑞月

本發明公開了一種谷氨酸脫羧酶及其基因和應用，谷氨酸脫羧酶的氨基酸序列為SEQ?ID?No.4，為一種谷氨酸脫羧酶突變體。谷氨酸脫羧酶突變體的最適反應溫度為55℃，最適反應pH為pH?5.0，Tsubgt;50/subgt;supgt;15/supgt;為59.1℃，60℃條件下的半衰期tsubgt;1/2/subgt;為25.6分鐘，對底物L?谷氨酸的米氏常數為26.80mM，催化效率為2.14ssupgt;?1/supgt;mMsupgt;?1/supgt;；具有良好的熱穩定性、底物親和力和催化活性。

技術領域

本發明涉及酶工程技術領域，具體涉及一種谷氨酸脫羧酶及其基因和應用。

背景技術

γ-氨基丁酸(GABA)是一種非蛋白天然氨基酸，具有降血壓、利尿、改善睡眠、抗抑郁等多種重要的生理功能，在醫藥、食品及化妝品等領域應用前景廣闊。生物法合成GABA不受資源、環境和空間等限制，是研究的一個主要方向。谷氨酸脫羧酶(glutamic?aciddecarboxylase,GAD；EC?4.1.1.15)是生物法合成GABA的關鍵限速酶，其能夠專一、不可逆地催化L-谷氨酸(或L-谷氨酸鹽)脫去α-羧基生成GABA并釋放出CO₂。獲取具有良好催化性能的谷氨酸脫羧酶是實現生物法高效合成GABA的重要前提。

目前，來源于乳酸乳球菌、嗜熱鏈球菌、屎腸球菌、植物乳桿菌、短促生乳桿菌、清酒乳桿菌、保加利亞乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、布氏乳桿菌、大腸桿菌、單核細胞增生李斯特氏菌、巨大芽孢桿菌、米曲霉、綠色木霉及少孢根霉等不同微生物染色體上的GAD基因已被克隆和異源表達，但隨后的酶學性質研究顯示，天然的GAD普遍存在熱穩定性差和催化活性低的缺陷。為此，包括國內外研究者通過拉氏圖信息、脯氨酸效應、蛋白質表面電荷優化、結構域增減、序列一致性等方法在一定程度上提升了GAD的催化性能，但生物法合成GABA在工業應用中，仍受到谷氨酸脫羧酶熱穩定性差、以及活性與熱穩定性不兼容等問題的制約。

近年來，來源于大腸桿菌(PDB?IDs.1XEY,3FZ6,3FZ7,3FZ8,2DGK,1PMO)與短促生乳桿菌(原短乳桿菌，PDB?ID.5GP4)的微生物源GAD晶體結構模型先后被解析，這為GAD的“結構-功能”關系提供了重要的信息。如何在提升谷氨酸脫羧酶熱穩定性的同時、強化其對底物的親和力并進一步提高其催化活性，具有重要的研究意義和價值。

發明內容

針對現有技術中存在的上述技術問題，本發明提供一種谷氨酸脫羧酶及其基因和應用，具有良好的熱穩定性、底物親和力和催化活性。

本發明公開了一種谷氨酸脫羧酶，所述谷氨酸脫羧酶的氨基酸序列為SEQ?IDNo.4。

優選的，氨基酸序列的獲取方法包括：

獲取短促生乳桿菌谷氨酸脫羧酶的野生型氨基酸序列；

固定野生型氨基酸序列的多個位點；

基于祖先酶序列重建方法，構建所述野生型氨基酸序列的祖先酶進化樹；

根據所述祖先酶進行樹，獲得所述谷氨酸脫羧酶的氨基酸序列。

優選的，所述位點包括以下氨基酸位點的組合：

F65,K89,C130,G164,Q166,W169,I178,M185,I211,T215,D246,A248,T254,L267,H278,K279和P285。

優選的，谷氨酸脫羧酶的制備方法包括：根據所述氨基酸序列，獲得相應的基因序列；合成并擴增所述基因序列；根據所述基因序列以及表達載體，構建重組質粒；根據所述重組質粒以及宿主，構建工程菌或工程細胞；利用工程菌或工程細胞表達重組蛋白；從表達重組蛋白的工程菌或工程細胞中分離純化谷氨酸脫羧酶。

優選的，構建工程菌的方法包括：