[發(fā)明專利]一種谷氨酸脫羧酶及其基因和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202310289400.8
• 申請(qǐng)日: 2023-03-23
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN116478974B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-10-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王東陽(yáng);孔建彪;戈連峰;呂常江;陳正
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東陽(yáng)成生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N9/88
• 分類號(hào): C12N9/88;C12N15/60;C12N15/70;C12N15/74;C12N1/21;C12P13/00;C12R1/19;C12R1/01
• 代理公司: 濟(jì)南果盾專利代理事務(wù)所(普通合伙) 37390
• 代理人: 馬瑞月

1.一種谷氨酸脫羧酶，其特征在于，所述谷氨酸脫羧酶的氨基酸序列為SEQ?ID?No.4。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的谷氨酸脫羧酶，其特征在于，氨基酸序列的獲取方法包括：

獲取短促生乳桿菌谷氨酸脫羧酶的野生型氨基酸序列；

固定野生型氨基酸序列的多個(gè)位點(diǎn)；

基于祖先酶序列重建方法，構(gòu)建所述野生型氨基酸序列的祖先酶進(jìn)化樹(shù)；

根據(jù)所述祖先酶進(jìn)行樹(shù)，獲得所述谷氨酸脫羧酶的氨基酸序列。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的谷氨酸脫羧酶，其特征在于，所述位點(diǎn)包括以下氨基酸位點(diǎn)的組合：

F65,K89,C130,G164,Q166,W169,I178,M185,I211,T215,D246,A248,T254,L267,H278,K279和P285。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的谷氨酸脫羧酶，其特征在于，谷氨酸脫羧酶的制備方法包括：

根據(jù)所述氨基酸序列，獲得相應(yīng)的基因序列；

合成并擴(kuò)增所述基因序列；

根據(jù)所述基因序列以及表達(dá)載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒；

根據(jù)所述重組質(zhì)粒以及宿主，構(gòu)建工程菌或工程細(xì)胞；

利用工程菌或工程細(xì)胞表達(dá)重組蛋白；

從表達(dá)重組蛋白的工程菌或工程細(xì)胞中分離純化谷氨酸脫羧酶。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的谷氨酸脫羧酶，其特征在于，構(gòu)建工程菌的方法包括：

設(shè)計(jì)第一引物對(duì)和第二引物對(duì)，其中第一引物對(duì)為：gadB₁₄₁₃-F1和gadB₁₄₁₃-R1，第二引物對(duì)為gadB1413-F2和gadB1413-R2；

分別以第一引物對(duì)和第二引物對(duì)，擴(kuò)增所述基因序列，獲得第一序列和第二序列；

利用限制性內(nèi)切酶Nde?I和Sal?I分別處理載體pET28a和純化后的第一序列，獲得雙酶切pET28a和雙酶切第一序列；通過(guò)T4-DNA連接酶，連接所述雙酶切pET28a和雙酶切第一序列，獲得第一質(zhì)粒；將所述第一質(zhì)粒導(dǎo)入E.coli?BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，獲得第一工程菌；

利用限制性內(nèi)切酶Nco?I和Kpn?I分別處理載體pNZ8149和純化后的第二序列，獲得雙酶切pNZ8149和雙酶切第二序列；通過(guò)T4-DNA連接酶，連接所述雙酶切pNZ8149和雙酶切第二序列，獲得第二質(zhì)粒；將所述第二質(zhì)粒導(dǎo)入L.lactis?NZ3900感受態(tài)細(xì)胞中，獲得第二工程菌。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的谷氨酸脫羧酶，其特征在于，所述谷氨酸脫羧酶的最適反應(yīng)溫度為55℃，最適反應(yīng)pH為pH?5.0，T₅₀¹⁵為59.1℃，60℃條件下的半衰期t_1/2為25.6分鐘，對(duì)底物L(fēng)-谷氨酸的米氏常數(shù)為26.80mM，催化效率為2.14s^-1mM^-1。

7.一種谷氨酸脫羧酶的基因序列，其特征在于，所述基因序列用于表達(dá)如權(quán)利要求1所述的谷氨酸脫羧酶。

8.根據(jù)權(quán)利要求7述的基因序列，其特征在于，所述基因序列為SEQ?IDNo.2。

9.一種如權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述谷氨酸脫羧酶的應(yīng)用，其特征在于，用于催化L-谷氨酸或L-谷氨酸鹽脫去α-羧基生成γ-氨基丁酸。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，基于谷氨酸脫羧酶突的氨基酸序列構(gòu)建的工程菌經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后，用于催化L-谷氨酸或L-谷氨酸鹽脫去α-羧基生成γ-氨基丁酸。