[發明專利]一種RPA-Cas12a一鍋法檢測系統及其應用

在審

• 申請號: 202310288775.2
• 申請日: 2023-03-22
• 公開（公告）號: CN116144814A
• 公開（公告）日: 2023-05-23
• 發明（設計）人: 黃和;王佩;楊莎;林蕾;張幸;李昺之
• 申請（專利權）人: 南京師范大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12N15/11;C12Q1/6844;C12R1/63
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 孫斌

本發明公開了一種RPA?Cas12a一鍋法快速檢測系統及其應用，該系統包括RPA預混液和CRISPR?Cas12a預混液；CRISPR?Cas12a預混液包括ssDNA、Cas12a和crRNA；crRNA為基于次優PAM序列設計的能引導Cas12a靶向識別AHPND?RPA產物的特異性向導RNA序列。本發明設計了特異性crRNA，降低Cas12a的切割效率，使RPA擴增過程與CRISPR?Cas12a特異性切割過程同時在一管中反應，避免了兩步法中轉移RPA擴增產物潛在的污染風險及繁瑣步驟，靈敏度高、穩定性好，為水產養殖業提供了高靈敏度、高準確性、穩定性好、簡便快捷的AHPND現場檢測方法。

技術領域

本發明屬于重要水產病害現場快檢，具體涉及一種RPA-Cas12a一鍋法檢測系統及其應用。

背景技術

急性肝胰腺壞死病(Acute?hepatopancreatic?necrosis?disease,AHPND)是對蝦養殖中最嚴重的傳染病之一。該疾病起病快、傳染性強、死亡率高，已給養殖業造成巨大的經濟損失。由于目前還沒有有效的治療方法，早期診斷是降低經濟損失的根本方法。AHPND的傳統診斷方法包括疾病相關癥狀分析和組織病理學特征分析。這些方法通常是費力的，耗時的，而且診斷結果不明確，需要依賴專業的操作人員。現代分子技術的應用使AHPND的診斷只需幾個小時即可完成，極大地提高了檢測效率。這些分子診斷方法都基于PCR，包括PCR、qPCR和巢式PCR，其中巢式PCR是AHPND分子診斷的金標準。然而這些基于PCR的分析不能滿足即時檢測(Point-of-care?testing，POCT)的需求，因為它們需要依賴實驗室的熱循環設備，往往不能滿足現場檢測需求。隨著技術的不斷發展，等溫擴增技術應運而生，基于環介導等溫擴增(LAMP)和重組酶聚合酶擴增(Recombinase?polymerase?amplification,RPA)等已成功應用于AHPND診斷，具有POCT目的。然而，由于發展年限尚淺，當前的等溫擴增技術并沒有PCR技術穩定，容易受到環境中多種因素的干擾。如LAMP反應條件等溫，擴增效率高，但假陽性信號概率高；與LAMP相比，RPA具有更方便的等溫條件(25-42°C)，與熒光探針或橫向流動試紙(LFD)結合時，可輕松應用于POCT，然而，基于RPA的側向流試紙條法和熒光法都需要使用昂貴的特異性探針，檢測成本高，反應信號來源于探針的切割，體系復雜，不穩定。將等溫擴增技術與CRISPR系統結合是解決這種困難的良好方法。在等溫擴增步驟的基礎上增加一步CRISPR-Cas蛋白的識別步驟，可以提高檢測的準確性和靈敏度。基于此原理，將RPA技術與CRISPR-Cas12a系統組合，已成功開發了DETECTR檢測技術，且該技術已廣泛應用于多種檢測方法的開發。基于DETECTR的檢測方法準確可靠，現有技術中公開了一種RPA-Cas12a檢測系統(中國申請號2022108198227)，然而，這種RPA擴增與CRISPR切割步驟分開的兩步法需要擴增子轉移步驟，操作不太便利，轉移步驟有污染的風險。因此開發更便捷的RPA-CRISPR一鍋法快速檢測蝦急性肝胰腺壞死病具有重要意義。

發明內容

發明目的：針對現有檢測技術將RPA與CRISPR/Cas12a聯合用于AHPND診斷的兩步法操作不適用于POCT且存在污染的風險，本發明提供了一種RPA-Cas12a一鍋法檢測系統，本發明利用基于次優原間隔相鄰基元(suboptimal?protospacer?adjacent?motifs，sPAM)設計的特殊crRNA并首次運用于肝胰腺壞死病系統，成功開發了一種RPA-CRISPR一鍋法檢測系統，將RPA擴增和CRISPR/Cas12a切割整合到同步反應中，克服了RPA擴增和Cas12a切割在一個反應管中的不兼容性問題(圖1)。整個檢測過程，只需要一次加樣步驟，避免了擴增子轉移過程中潛在的污染問題，簡化了操作步驟，同時檢測靈敏度顯著提高。本發明為具有POCT目的AHPND診斷提供了新的選擇，為開發RPA-CRISPR一鍋分子診斷方法提供了良好的借鑒。

本發明還提供了RPA-Cas12a一鍋法檢測系統在重要水產養殖傳染病肝胰腺壞死病的快速現場檢測中的應用。