[發明專利]一種RPA-Cas12a一鍋法檢測系統及其應用在審
| 申請號： | 202310288775.2 | 申請日： | 2023-03-22 |
| 公開（公告）號： | CN116144814A | 公開（公告）日： | 2023-05-23 |
| 發明（設計）人： | 黃和;王佩;楊莎;林蕾;張幸;李昺之 | 申請（專利權）人： | 南京師范大學 |
| 主分類號： | C12Q1/689 | 分類號： | C12Q1/689;C12N15/11;C12Q1/6844;C12R1/63 |
| 代理公司： | 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204 | 代理人： | 孫斌 |
| 地址： | 210024 江*** | 國省代碼： | 江蘇;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 rpa cas12a 一鍋 檢測 系統 及其 應用 | ||
1.一種RPA-Cas12a一鍋法檢測系統，其特征在于，包括RPA預混液和CRISPR-Cas12a預混液；所述RPA預混液包括用于擴增RPA產物的正向引物RPA-F和反向引物RPA-R；所述CRISPR-Cas12a預混液包括ssDNA、Cas12a和crRNA；所述ssDNA為兩端分別修飾有熒光基團FAM和猝滅基團BHQ1的單鏈DNA；crRNA為基于次優PAM序列設計的能引導Cas12a靶向識別AHPND?RPA產物的特異性向導RNA序列。
2.根據權利要求1所述的RPA-Cas12a一鍋法檢測系統，其特征在于，所述RPA-F的序列為CATCTTTGACGGAATTTAACCCTAACAAT；所述RPA-R的序列為TAACTAAACCAATGTAATCATCTTTTGC。
3.根據權利要求1所述的RPA-Cas12a一鍋法檢測系統，其特征在于，所述ssDNA的序列為5’FAM-TTATT-3’BHQ1。
4.根據權利要求1所述的RPA-Cas12a一鍋法檢測系統，其特征在于，所述crRNA序列優選為UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUAUUAAUGUCUUGAAUUUUAUC。
5.根據權利要求1所述的RPA-Cas12a一鍋法檢測系統，其特征在于，所述RPA預混液中還包括RPA?Buffer?A和DEPC水；所述RPA-Cas12a一鍋法檢測系統中還包括RPA?Buffer?B。
6.根據權利要求1所述的RPA-Cas12a一鍋法檢測系統，其特征在于，所述CRISPR-Cas12a預混液包括LbCas12a、10X?NEB?Buffer?2.1、crRNA和熒光分子ssDNA-FQ。
7.一種權利要求1所述的RPA-Cas12a一鍋法檢測系統在重要水產養殖傳染病肝胰腺壞死病的快速現場檢測中的應用。
8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于，所述快速現場檢測的方法為：將RPA預混液、Cas12a預混液和模板DNA加入RPA?Buffer?B混合在實時熒光定量PCR儀中進行一鍋反應，進行熒光定量PCR，反應過程中采集FAM熒光信號，終點信號在紫外線下可見，并拍攝圖像。
9.根據權利要求6所述的應用，其特征在于，所述模板DNA為含或者不含AHPND毒力基因pirB上一段區別于其他物種的保守序列的模板DNA。
10.一種權利要求1所述的RPA-Cas12a一鍋法檢測系統在制備重要水產養殖傳染病肝胰腺壞死病的快速現場檢測試劑盒中的應用。
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