[發(fā)明專利]一種梣酮-血藍(lán)蛋白免疫原及其多克隆抗體與制備方法、應(yīng)用在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 202310277928.3 | 申請日： | 2023-03-21 |
| 公開（公告）號： | CN116425861A | 公開（公告）日： | 2023-07-14 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 潘潔;鄭江;李維維;胡紫霞;伍楚天 | 申請（專利權(quán)）人： | 貴州醫(yī)科大學(xué) |
| 主分類號： | C07K14/795 | 分類號： | C07K14/795;C07K1/107;C07K16/16;G01N33/53;G01N33/68 |
| 代理公司： | 貴州派騰知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 52114 | 代理人： | 龍遠(yuǎn)寧 |
| 地址： | 550004 *** | 國省代碼： | 貴州;52 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 蛋白 免疫原 及其 克隆 抗體 制備 方法 應(yīng)用 | ||
本發(fā)明涉及生物化學(xué)和分子免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種梣酮?血藍(lán)蛋白免疫原及其多克隆抗體與制備方法、應(yīng)用。本申請基于免疫化學(xué)法，選擇高免疫原性的血藍(lán)蛋白(KLH)作為載體蛋白，與梣酮(FRA)化學(xué)合成免疫原，將免疫原接種于新西蘭大白兔使其產(chǎn)生可以特異性識別梣酮?蛋白加合物的多克隆抗體。該抗體可以特異性識別蛋白加合物中FRA?pyrroline和FRA?pyrrole結(jié)構(gòu)，利用該抗體可對誘發(fā)肝損傷的蛋白靶點(diǎn)進(jìn)行ELISA、Westernblot和免疫熒光檢測，為白鮮皮及FRA代謝活化后形成的中間體共價修飾的蛋白質(zhì)的定性、半定量和可視化定位提供有力的研究工具。
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及生物化學(xué)和分子免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種梣酮-血藍(lán)蛋白免疫原及其多克隆抗體與制備方法、應(yīng)用。
背景技術(shù)
白鮮皮為蕓香科植物白鮮Dictamnus?dasycarpus?Turcz.的干燥根皮。具有清熱燥濕，祛風(fēng)解毒之功效，現(xiàn)代藥理作用研究表明其具有抗腫瘤、抗炎、止血、抗氧化等活性。特別是在治療皮膚病方面具有顯著療效。隨著白鮮皮藥材及相關(guān)制劑的應(yīng)用，肝毒性相關(guān)的報(bào)道逐漸增加，近年來其誘導(dǎo)的藥物性肝損傷雖然已經(jīng)引起關(guān)注，但具體的致毒機(jī)制仍不清楚。
梣酮(FRA)是白鮮皮藥材中的特征性成分，作為其含量測定的控制指標(biāo)被收載于《中國藥典》(2020版)。研究發(fā)現(xiàn)白鮮皮中梣酮可誘導(dǎo)小鼠和斑馬魚肝損傷，給以CYP3A選擇性抑制劑酮康唑和親核性試劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)共同處理可顯著改善小鼠肝損傷。梣酮是呋喃萜類化合物，根據(jù)對呋喃和含呋喃結(jié)構(gòu)的天然化學(xué)成分的報(bào)道，這些化合物誘導(dǎo)的肝毒性主要與呋喃環(huán)的代謝有關(guān)。呋喃環(huán)經(jīng)P450酶催化代謝為順稀二醛(cis-enedial)中間體，是一種強(qiáng)親電試劑，可迅速與蛋白質(zhì)上的半胱氨酸(Cys)和/或賴氨酸(Lys)發(fā)生共價結(jié)合形成吡咯啉(Pyrroline)或吡咯(Pyrrole)結(jié)構(gòu)的加合物，故這些蛋白質(zhì)加合物的形成被認(rèn)為是毒性作用的一個重要觸發(fā)因素。當(dāng)共價結(jié)合發(fā)生后，蛋白質(zhì)的原有功能可能會降低甚至失活，進(jìn)一步影響肝細(xì)胞正常功能甚至引起細(xì)胞死亡，最終導(dǎo)致肝損傷，因此被共價修飾的蛋白質(zhì)的識別與檢測具有重要意義。
因此，尋找一種可特異性識別蛋白加合物中FRA-pyrroline和FRA-pyrrole結(jié)構(gòu)的抗體，是目前急需解決的問題。
發(fā)明內(nèi)容
為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種梣酮-血藍(lán)蛋白免疫原及其多克隆抗體與制備方法、應(yīng)用。
一種梣酮-血藍(lán)蛋白免疫原，是選擇高免疫原性的血藍(lán)蛋白(KLH)作為載體蛋白，與梣酮(FRA)化學(xué)合成得到。
進(jìn)一步的，所述梣酮-血藍(lán)蛋白免疫原，是通過如下方法制備得到：取梣酮，加入丙酮，充分溶解后，再加入DMDO，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)，37℃下N2流吹干，殘?jiān)尤隢ative?KLH溶液，常溫?cái)嚢璺磻?yīng)1，即得免疫原FRA-KLH。
進(jìn)一步的，所述步驟具體如下：精密稱取梣酮7.3mg，加入丙酮750μL，充分溶解后，再加入DMDO?1.5mL，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)30min，37℃下N2流吹干，殘?jiān)尤隢ative?KLH溶液1.48mL，常溫?cái)嚢璺磻?yīng)1h，即得免疫原FRA-KLH。
一種選擇性識別梣酮-蛋白共價結(jié)合物的多克隆抗體，采用所述的免疫原免疫動物后制備得到。
進(jìn)一步的，所述免疫動物后制備得到，是對家兔進(jìn)行免疫接種后分離血清得到。
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