[發明專利]一種中華絨螯蟹螺原體MIRA和MIRA-LFD檢測方法及其應用

在審

• 申請號: 202310248882.2
• 申請日: 2023-03-15
• 公開（公告）號: CN116219045A
• 公開（公告）日: 2023-06-06
• 發明（設計）人: 孟慶國;安德瑞;宮思楠;黃燕蘭;顧偉;王文
• 申請（專利權）人: 南京師范大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 南京眾聯專利代理有限公司 32206
• 代理人: 王荷英

本發明公開了一種中華絨螯蟹螺原體MIRA和MIRA?LFD檢測方法及其應用，MIRA技術對樣本及實驗室環境要求較低，可將少量核酸分子擴增至可檢出水平，結合側流層析試紙條（LFD）形成MIRA?LFD快速診斷方法；同時，中華絨螯蟹螺原體MIRA、MIRA?LFD的方法還具有高度的特異性，在靈敏度的表現上也更強于PCR；同時中華絨螯蟹螺原體的MIRA、MIRA?LFD的檢測方法具有快速、靈敏、特異性強、不需要特殊儀器等優點，適合中華絨螯蟹螺原體的快速檢測，可以適用于臨床樣品檢測。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種中華絨螯蟹螺原體MIRA和MIRA-LFD檢測方法及其應用。

背景技術

中華絨螯蟹（俗稱河蟹）在中國的淡水養殖業中占有重要地位，其經濟價值和營養價值較高。隨著中華絨螯蟹養殖快速、大規模的發展，致使水體環境狀況急劇惡化，病害經常發生且越來越嚴重，其中較為嚴重的病害就是河蟹“顫抖病”，其對中華絨螯蟹的養殖產業造成了巨大的損失。近些年來，對于河蟹顫抖病的發病機制一直尚不明確，有的認為是病毒，有的認為是細菌以及生存環境起重要作用，還有人提出其病原體為類立克次體微生物，直到2003年王文等首次從發病的中華絨螯蟹中分離出病原，經系統分類學、血清學等方面的研究，將其命名為中華絨螯蟹螺原體（ Spiroplasma?eriocheiris,?Se）。

目前針對中華絨螯蟹螺原體的檢出常用的檢測方法有蛋白質印跡法、普通PCR、RT-PCR和LAMP，但這些方法存在容易污染、操作繁瑣、敏感性中等、存在非特異性擴增、耗時長、需要專業儀器設備等缺點。因此亟需一種操作簡單，特異性強的中華絨螯蟹螺原體檢測方法。

發明內容

為解決上述問題，本發明公開了一種中華絨螯蟹螺原體MIRA和MIRA-LFD檢測方法及其應用，MIRA技術對樣本及實驗室環境要求較低，可將少量核酸分子擴增至可檢出水平，結合側流層析試紙條（LFD）形成?MIRA-LFD快速診斷方法；同時，中華絨螯蟹螺原體MIRA、MIRA-LFD的方法還具有高度的特異性，在靈敏度的表現上也更強于PCR；同時中華絨螯蟹螺原體的MIRA、MIRA-LFD的檢測方法具有快速、靈敏、特異性強、不需要特殊儀器等優點，適合中華絨螯蟹螺原體的快速檢測，可以適用于臨床樣品檢測。

為達到上述目的，本發明的技術方案如下：

一種中華絨螯蟹螺原體MIRA和MIRA-LFD檢測方法，包括以下步驟：

S1.引物和探針的合成與篩選；

S2.MIRA反應體系的建立；

S3.MIRA-LFD反應體系的建立；

S4.特異性檢測。

作為本發明的一種改進，所述步驟S1的具體操作步驟如下：

（1）設計引物：使用30-35bp的引物，無二級結構，擴增片段大小150-300bp，通過Olige6軟件設計4對引物；

（2）初步篩選：在上下游引物中間，設計一長度為46-52nt與目的片段互補的序列，5端修飾一個FAM，在5’端與3’’端的中部位置標記一個dSpacer（四氫呋喃，THF），作為nfo的識別位點，3’末端標記一個修飾基團（C3spacer），通過Olige6軟件設計出2對探針引物；

（3）最終篩選：將兩組引物進行最后篩選，最終得出1組片段大小約為186bp與預期大小一致的292F/446R引物用于后續MIRA方法檢測，并以此片段設計出一組探針引物用于后續MIRA-LFD方法檢測。

作為本發明的一種改進，所述步驟S2的具體操作步驟如下：

（1）建立25μL的MIRA反應體系，向凍干混合酶中加入29.4μL溶解緩沖液（ABuffer），將其均分為2份；