[發(fā)明專利]一種中華絨螯蟹螺原體MIRA和MIRA-LFD檢測(cè)方法及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202310248882.2
• 申請(qǐng)日: 2023-03-15
• 公開（公告）號(hào): CN116219045A
• 公開（公告）日: 2023-06-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孟慶國;安德瑞;宮思楠;黃燕蘭;顧偉;王文
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京師范大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/689
• 分類號(hào): C12Q1/689;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 南京眾聯(lián)專利代理有限公司 32206
• 代理人: 王荷英

1.一種中華絨螯蟹螺原體MIRA和MIRA-LFD檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1.引物和探針的合成與篩選；

S2.MIRA反應(yīng)體系的建立；

S3.MIRA-LFD反應(yīng)體系的建立；

S4.特異性檢測(cè)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種中華絨螯蟹螺原體MIRA和MIRA-LFD檢測(cè)方法，其特征在于：所述步驟S1的具體操作步驟如下：

（1）設(shè)計(jì)引物：使用30-35bp的引物，無二級(jí)結(jié)構(gòu)，擴(kuò)增片段大小150-300bp，通過Olige6軟件設(shè)計(jì)4對(duì)引物；

（2）初步篩選：在上下游引物中間，設(shè)計(jì)一長(zhǎng)度為46-52nt與目的片段互補(bǔ)的序列，5端修飾一個(gè)FAM，在5’端與3’’端的中部位置標(biāo)記一個(gè)dSpacer（四氫呋喃，THF），作為nfo的識(shí)別位點(diǎn)，3’末端標(biāo)記一個(gè)修飾基團(tuán)（C3spacer），通過Olige6軟件設(shè)計(jì)出2對(duì)探針引物；

（3）最終篩選：將兩組引物進(jìn)行最后篩選，最終得出1組片段大小約為186bp與預(yù)期大小一致的292F/446R引物用于后續(xù)MIRA方法檢測(cè)，并以此片段設(shè)計(jì)出一組探針引物用于后續(xù)MIRA-LFD方法檢測(cè)。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種中華絨螯蟹螺原體MIRA和MIRA-LFD檢測(cè)方法，其特征在于：所述步驟S2的具體操作步驟如下：

（1）建立25μL的MIRA反應(yīng)體系，向凍干混合酶中加入29.4μL溶解緩沖液（A?Buffer），將其均分為2份；

（2）向每份加入中華絨螯蟹螺原體DNA?1μL，無菌無酶水6.05μL、10μmol/L的正向引物1μL、10μmol/L的反向引物1μL、醋酸鎂（B?Buffer）1.25μL；

（3）將混合物混勻，震蕩1s離心1s，重復(fù)兩次，立即放到水浴鍋中反應(yīng)，得到MIRA產(chǎn)物；

（4）將MIRA產(chǎn)物通過酚：氯仿：異丙醇=25：24：1進(jìn)行抽提，隨后用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種中華絨螯蟹螺原體MIRA和MIRA-LFD檢測(cè)方法，其特征在于：所述步驟S3的具體操作步驟如下：

（1）建立25μL的MIRA-LFD反應(yīng)體系，向凍干混合酶中加入29.4μL溶解緩沖液（ABuffer），將其均分為2份；

（2）向每份加入中華絨螯蟹螺原體DNA?1μL，無菌無酶水6.85μL，1μmol/L的正向引物0.5μL、1μmol/L的反向引物0.5μL、醋酸鎂（B?Buffer）1.25μL；

（3）將混合物混勻，震蕩1s離心1s，重復(fù)兩次，立即放到水浴鍋中反應(yīng)，得到MIRA-LFD產(chǎn)物；

（4）取10μL反應(yīng)產(chǎn)物于20μL的PCR小管中，向其加入95μL的無菌無酶水，混勻，將側(cè)向?qū)游黾垪l插入，靜置5min后觀察結(jié)果。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種中華絨螯蟹螺原體MIRA和MIRA-LFD檢測(cè)方法，其特征在于：所述步驟S4的具體操作步驟如下：用篩選的最佳引物與一定反應(yīng)條件，分別以枯草芽孢桿菌、蘇云金桿菌、金黃葡萄球菌、大腸桿菌、嗜水氣單胞菌、沙門氏桿菌、中華絨螯蟹螺原體的DNA為模板，同時(shí)設(shè)置了一個(gè)空白對(duì)照，進(jìn)行MIRA、MIRA-LFD檢測(cè)。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種中華絨螯蟹螺原體MIRA和MIRA-LFD檢測(cè)方法，其特征在于：所述反應(yīng)條件具體為：MIRA、MIRA-LFD的反應(yīng)溫度為37℃、反應(yīng)時(shí)間為10min。

7.一種根據(jù)權(quán)利要求1-6任一所述檢測(cè)方法在中華絨螯蟹螺原體中的應(yīng)用。

8.一種根據(jù)權(quán)利要求1-6任一所述檢測(cè)方法在臨床樣品檢測(cè)中的應(yīng)用。